В последние 30 лет появление молекулярных методов исследования реаранжировки генов имму­ноглобулинов и генов Т-клеточных рецепторов, соз­дание поли- и моноклональных антител и иммуно-гистохимической техники сыграли решающую роль в изучении биологических основ и диагностике лим­фом. В свою очередь детальная биологическая хара­ктеристика заболевания служит основой для созда­ния новых морфологических классификаций, что позволяет на более высоком уровне, с применением иммунологических и молекулярных методов иссле­дования осуществлять диагностику и дифференци­альную диагностику лимфом, сходных на светооптическом уровне. В настоящее время «золотым стан­дартом» диагностики лимфомы стало морфологиче­ское исследование биопсийного материала с после­дующим иммунофенотированием в целях верифика­ции варианта лимфомы и выявления возможных прогностических маркеров. Иммунофенотипирование можно проводить на свежезамороженных срезах (чаще — с помощью метода непрямой флюоресцен­ции) и на срезах с парафинового блока с помощью иммуногистохимического (иммуноферментного) метода. Возможность использования парафинового материала для верификации диагноза и варианта лимфомы обусловила широкое применение имму­ногистохимического метода. Для иммуногистохими­ческого метода в гемопатологии применяются поли-(кроличьи) и моноклональные (мышиные) антите­ла, входящие в номенклатуру CD (кластеров лейко­цитарной дифференцировки), антитела к активаци-онным антигенам, онкобелкам, различным классам иммуноглобулинов, легким цепям, многие другие антитела. Применение мабтеры — анти-CD20-мо-ноклонального препарата, вызывающего апоптоз CD20-положительных опухолевых клеток, подразу­мевает обязательную верификацию варианта неходжкинской лимфомы. Так, например, опухолевые клетки при плазмобластной лимфоме — варианте диффузной В-крупноклеточной лимфомы — не экспрессируют CD20, следовательно, мабтера, нацелен­ная на CD20-позитивные опухолевые клетки, будет неэффективной и не должна применяться при дан­ном варианте лимфомы.

В-клеточные лимфомы

В-клеточные лимфомы составляют до 85% не-ходжкинских лимфом и происходят из В-клетки на различных стадиях дифференцировки.

Выделяют 4 этапа В-клеточной дифференци­ровки: костномозговые клетки-предшественницы (про-В-клетка, пре-В-клетка, незрелая В-клетка); зрелые наивные В-клетки; фолликулярные В-клетки (центробласт и центроцит); постфолликулярные В-клетки (В-клетка памяти, плазматическая клетка). Среди маркеров костномозговой дифференцировки, включающих в себя CD10, CD19, CD34, CD79a, не­обходимо особенно выделить TdT (терминальную деоксинуклеотидилтрансферразу) и PAX 5 (BSAP). На уровне костномозговой дифференцировки в В-клетках начинается реаранжировка генов локуса тя­желых цепей иммуноглобулинов. После завершения процесса рекомбинации ген TdT выключается. Та­ким образом, все периферические (зрелые) В-клетки TdT-негативны. BSAP (В-клеточный специфиче­ский белок) — ядерный ДНК-связывающий белок, кодируемый геном PAX 5. PAX 5 играет важную роль в развитии и созревании В-клетки [1, 2].

Маркерами фолликулярной дифференциров­ки являются CD 10 и транскрипционный фактор BCL-6, что отличает В-клетку фолликула от зрелой наивной В-клетки. Таким образом, CD10 (CALLA — общий антиген острого лимфобластного лейкоза, другое название — неприлизин) экс-прессируется костномозговыми клетками-предше­ственницами на стадиях про-В-, пре-В-клетки, не­зрелой В-клетки костного мозга, не выявляется на стадии зрелой наивной В-клетки и вновь экспрессируется В-клетками на уровне фолликулярной дифференцировки. BCL-6 — антиапоптотический белок, являю­щийся ключевым регулятором формирования и функции зародышевого центра. BCL-6 ингибирует дифференцировку В-клеток зародышевого центра фолликула в плазматические клетки путем связыва­ния с трансдуцерами и активаторами, предотвраща­ющими экспрессию главного регулятора плазмокле-точной дифференцировки Blimp-1. Блокировка экс­прессии BCL-6 в условиях нормы необходима для дальнейшей дифференцировки В-клеток. У человека в условиях физиологической нормы высокий уро­вень белка BCL-6 обнаруживается только в В-клет-ках зародышевого центра — центробластах и центро-цитах — и не выявляется в клетках пре- и постфолли­кулярных стадий. Необходимо подчеркнуть, что в ус­ловиях нормы клетки зародышевых центров вторич­ных фолликулов не экспрессируют антиапоптотический белок BCL-2, т.е. нечувствительны к сигналам блокировки апоптоза по митохондриальному пути.

Плазмоклеточная дифференцировка начина­ется в светлой зоне зародышевого центра, ассоци­ирована с миграцией В-клетки за пределы фолли­кула и может быть идентифицирована с помощью иммуногистохимического окрашивания с исполь­зованием антител к CD38, CD 138 (Syndecan-1), MUM.1/IRF4 (множественная миелома 1/интер-феронрегуляторный фактор-4). MUM.1 экспрес-сируется на поздней стадии фолликулярной и постфолликулярной (плазмоцитарной) диффе-ренцировки В-клеток; позитивны, в основном, плазматические клетки, единичные В-клетки фол­ликулов, а также небольшая часть Т-клеток. На этом этапе, как правило, снижается экспрессия пан-В-клеточных антигенов CD19, CD20, PAX 5, а также поверхностного иммуноглобулина, что со­провождается возрастанием цитоплазматической секреции иммуноглобулинов.

В результате В-клеточной дифференцировки различают 3 главные зрелые формы В-клеток:

• зрелая наивная В-клетка;
• В-клетка зародышевого центра фолликула;
• постфолликулярная В-клетка.

Классификация опухолей лимфоидной ткани
(ВОЗ 2001) [3]

В-клеточные опухоли

Опухоли из предшественников В-клеток Лимфобластный лейкоз/лимфома из предшественни­ков В-клеток

• Зрелые В-клеточные опухоли Хронический лимфоцитарный лейкоз/лимфома из ма­лых лимфоцитов
• В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз Лимфоплазмоцитарная лимфома/макроглобулинемия Вальденстрема
• Лимфома маргинальной зоны селезенки Волосатоклеточный лейкоз Плазмоклеточные опухоли Плазмоклеточная миелома Плазмоцитома
• Болезни отложения моноклональных иммуноглобулинов Болезни тяжелых цепей
• Экстранодальная В-клеточная лимфома маргинальной зоны из ассоциированной со слизистыми оболочками лимфоидной ткани (MALT-лимфома) Нодальная В-клеточная лимфома маргинальной зоны Фолликулярная лимфома Лимфома из клеток мантии Диффузная В-крупноклеточная лимфома Медиастинальная (тимическая) В-крупноклеточная лимфома
• Внутрисосудистая В-крупноклеточная лимфома Первичная лимфома серозных оболочек
• Лимфома/лейкоз Беркитта
• В-клеточный лимфоматоидный гранулематоз

Далее кратко обозначим вопросы морфологи­ческой дифференциальной диагностики наиболее часто встречающихся В-клеточных лимфом, сфор­мированных в соответствующие группы. Верифика­ция варианта лимфомы возможна при иммуногисто-химическом исследовании с использованием пра­вильно сформированной панели поли- и монокло­нальных антител, позволяющей выявить «диагно­стический» комплекс положительных реакций или «маркерный» антиген.

Дифференциальная диагностика лимфобластной лимфомы и лимфомы Беркитта

Морфологическим субстратом лимфобластной лимфомы (из предшественников) являются бласт-ные клетки средних размеров с округло-овальными и неправильными ядрами, высоким ядерно-цито-плазматическим соотношением, высокой митотической активностью.

Проведение иммуногистохимического иссле­дования необходимо для установления В- или Т-линейной принадлежности лимфобластной лимфомы, так как на светооптическом уровне лимфобластные лимфомы из В- и Т-клеток-предшественниц нераз­личимы. При наличии морфологической картины бластной лимфомы, представленной мономорфны-ми клетками средних размеров с округло-овальными ядрами с наличием Беркиттоподобных участков, не­обходима дифференциальная диагностика с лимфо-мой Беркитта, имеющей фолликулярное происхож­дение.

Дифференциальная диагностика В-мелкоклеточных лимфом

Группа В-мелкоклеточных лимфом включает в себя:

• лимфому из малых лимфоцитов;
• лимфому из клеток мантии;
• фолликулярную лимфому;
• лимфому из клеток маргинальной зоны.

Лимфома из малых лимфоцитов
Морфологическая картина лимфомы из малых лимфоцитов, идентичная субстрату B-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза (В-ХЛЛ), характеризуется диффузным разрастанием опухоле­вых клеток с морфологией малых лимфоцитов: кле­ток с округлыми ядрами, комковатым хроматином, неотчетливыми ядрышками. В различном количест­ве встречаются пролимфоциты — клетки средних размеров с отчетливыми центрально расположенны­ми небольшими ядрышками, и параиммунобласты. Кроме типичной морфологии наличие в опухолевой популяции клеток с неправильными ядрами создает трудности в дифференциальной диагностике с дру­гими мелкоклеточными лимфомами и получило название «атипичного варианта лимфомы из малых лимфоцитов».

В настоящее время выделяют 2 группы больных лимфомой из малых лимфоцитов/В-ХЛЛ. 1-я группа составляет 30—40% от всех случаев, характеризуется отсутствием соматического гена гипермутаций тя­желых цепей вариабельной области иммуноглобули­на (IgVH) опухолевых клеток и является прогности­чески неблагоприятной. Маркерами неблагоприят­ного течения, тесно коррелирующими с отсутствием вышеуказанных мутаций опухолевого клона, явля­ются активационный антиген CD38 (более 30% по­ложительных опухолевых клеток) и ZAP 70 — белок, ассоциированный с |-цепью Т-клеточного рецепто­ра (>20% положительных опухолевых клеток) [4]. Если В-клетка — предшественница лимфомы из ма­лых лимфоцитов прошла фолликулярную диффе-ренцировку, а значит, имеет мутации IgVH, клиниче­ское течение лимфомы из малых лимфоцитов более благоприятно.

Лимфома из клеток мантии

Опухолевым субстратом являются клетки с не­правильными и округло-овальными светлыми ядра­ми, нередко отчетливо видны признаки перинукле-арной конденсации хроматина. Морфологически выделяют классический и бластоидный варианты. Маркером данного варианта лимфомы является экс­прессия белка сyclinD1, образующегося в результате t(11;14)(q13;q32) и выявляемого при иммуногистохимическом исследовании.

Фолликулярная лимфома

Фолликулярная лимфома несет в себе черты предсуществующего вторичного фолликула: ее кле­точный состав включает в себя центроциты и цент-робласты, в основе нодулей имеется организованная сеть фолликулярных дендритических клеток (ФДК), присутствует выраженная инфильтрация Т-клетками.

По клеточному составу выделяют III цитологи­ческих типа фолликулярной лимфомы. Воспроизво­димость их далека от совершенства, по крайней ме­ре, по двум причинам: во-первых, при гистологиче­ском исследовании нередко трудно c уверенностью дифференцировать ФДК с округлоовальным ядром и центробласт; во-вторых, трудно визуализировать диффузные участки роста без иммуногистохимического выявления сети ФДК. Важно подчеркнуть, что уровень пролиферативной активности, оценивае­мый по экспрессии Ki-67, не может служить индика­тором цитологического типа и варьирует от 10 до 75% при различных цитологических типах фоллику­лярной лимфомы. Клеткой -предшественницей фолликулярной лимфомы является фолликулярная В-клетка, несу­щая мутации генов IgVH и признаки продолжаю­щихся гипермутаций (путем выявления внутриклоновой гетерогенности). Цитогенетическим марке­ром фолликулярной лимфомы является t(14;18)(q32;q21), которая отмечается примерно в 85% случаев фолликулярной лимфомы I и II цито­логического типов, выявляется иммуногистохимически [5]. Необходимо заметить, что данная транс-локация отмечается в 15—20% случаев диффузной В-крупноклеточной лимфомы (В-ДККЛ), что, воз­можно, является признаком опухолевой трансфор­мации фолликулярной лимфомы: трансформация фолликулярной лимфомы в В-ДККЛ в течение пер­вых 10 лет после установления диагноза отмечается в 30—50% случаев. В результате t(14;18) онкоген BCL-2, локализующийся на 18-й хромосоме, оказы­вается в локусе генов тяжелых цепей иммуноглобу­линов на 14-й хромосоме, что приводит к его кон­ститутивной экспрессии. Однако это лишь первое событие в длинной цепочке генетических поломок, приводящих к возникновению опухолевого клона. Кроме того, экспрессия BCL-2 при фолликулярной лимфоме может отмечаться и без t(14;18)(q32;q21), наблюдается практически при всех В-мелкоклеточ­ных лимфомах (что выявляется иммуногистохими-чески), скорее, за счет нарушений транскрипцион­ной регуляции. В последние годы появились сведения о том, что в фолликулярной лимфоме могут встречаться Беркиттоподобные участки, что является гистологи­ческим признаком опухолевой трансформации [6].

Нодальная лимфома из клеток маргинальной зоны

В лимфатическом узле выделяют 2 морфологи­ческих варианта данной лимфомы. Представляется важным подчеркнуть, что при иммуногистохимическом исследовании на парафиновых срезах с ис­пользованием высокотемпературной обработки да­леко не всегда удается выявить моноклональность опухолевых клеток. Учитывая сходство в лимфатическом узле мор­фологической и иммунофенотипической картины лимфомы из клеток маргинальной зоны и лимфоплазмоцитарной лимфомы/макроглобулинемии Вальденстрема, в настоящее время широко обсужда­ется вопрос о том, являются ли эти лимфомы раз­личными клинико-морфологическими вариантами или они едины по своей биологической сущности и клиническому течению. Добавим к этому, что до 60% наблюдений лимфомы из клеток маргинальной зоны характеризуются поражением костного мозга [7].

Лимфома Беркитта и ее дифференциальная диагностика

Лимфома Беркитта имеет фолликулярное центробластное происхождение. Морфологическая кар­тина характеризуется мономорфными бластными клетками средних размеров с насыщенным рисун­ком хроматина, множественными неотчетливыми ядрышками, узким ободком интенсивно пиронинофильной цитоплазмой, высокой митотической ак­тивностью. Морфологические признаки апоптоза ярко выражены, макрофаги фагоцитируют апоптотические тельца, что создает картину «звездного не­ба». Иммунофенотип опухолевых клеток в полной мере отражает ее фолликулярное происхождение: CD20+, IgM+, CD10+, BCL-6+. Для лимфомы Беркитта характерны коэкспрессия практически всеми опухолевыми клетками CD43 и высокий уровень пролиферативной активности, оцениваемый по уровню экспрессии Ki-67 и достигающий почти 100% в сохранных опухолевых клетках. Особое зна­чение для верификации данного варианта лимфомы имеет генетическое изучение — выявление реаран-жировки онкогена MYC и гиперэкспрессии MYC c участием локуса генов тяжелых цепей иммуноглобу­линов при транслокации t(8;14)(q24;q32). Эта транс­локация выявляется в 80% случаев. В 20% отмечают­ся транслокации с участием локусов генов легких це­пей иммуноглобулинов t(2;8)(p12;q24) иt(8;22)(q24;q11).

При морфологическом исследовании наиболь­шие трудности вызывает атипичный вариант лим­фомы Беркитта с более крупными и полиморфными ядрами, отдельными клетками с отчетливыми ук­рупненными ядрышками (в REAL-классификации большинство таких случаев относились к Беркитто-подобной лимфоме) или присутствие Беркиттопо-добных участков в субстрате В-ДККЛ (центробласт-ной). В ряде случаев при В-ДККЛ выражены при­знаки апоптоза, многочисленные макрофаги с фаго­цитозом апоптотических телец создают картину «звездного неба». Вместе с тем известно, что в 10% случаев при В-ДККЛ отмечается идентичная транслокация t(8;14)(q24;q32) с вовлечением протоонкогена MYC, что является признаком агрессивного клинического течения. Таким образом, диагностика лимфомы Бер­китта требует корректной оценки каждой составля­ющей диагноза: морфологической, иммунофенотипической картины, генетического исследования, клинических данных.

В-ДККЛ и особенности иммунофенотипа

В-ДККЛ могут возникать de novo или в резуль­тате опухолевой трансформации зрелоклеточных В-клеточных лимфом: В-ХЛЛ/лимфомы из малых лимфоцитов, лимфоплазмоцитарной лимфомы, лимфомы из клеток маргинальной зоны или фолли­кулярной лимфомы (синдром Рихтера). В настоящее время проводятся исследования по клинико-иммунофенотипическому сопоставле­нию В-ДККЛ в плане разделения их на группы фол­ликулярного и постфолликулярного происхождения [8]. Как указывалось выше, маркерами фолликуляр­ного происхождения являются CD10, BCL-6; маркерами постфолликулярного происхождения, которые экспрессируются активированными (антигенинду-цированными) В-клетками, являются CD138, MUM.1. При наличии экспрессии MUM.1 и отсут­ствии экспрессии BCL-6 и CD138 лимфому относят к поздней фолликулярной/ранней постфолликуляр­ной дифференцировке. Таким образом, выделяют диффузные В-крупноклеточные лимфомы:

• фолликулярного происхождения (CD 10+и/или BCl-6+);
• из активированных клеток центра фолликула с экспрессией одного маркера фолликулярного про­исхождения и одного активационного маркера (CD138 или MUM.1);
• из активированных нецентрофолликулярных клеток (MUM.1+ и/или CD138+).

Экспрессия маркеров фолликулярной диффе-ренцировки является фактором благоприятного те­чения заболевания [9, 10]. Экспрессия маркеров постфолликулярного происхождения или сочетание одного из маркеров фолликулярного и постфолли­кулярного происхождения ассоциировано с худшим прогнозом. Между морфологической картиной и иммунофенотипическими характеристиками опу­холи в плане ее фолликулярного или постфоллику­лярного происхождения не отмечено какой-либо за­висимости. Экспрессия BCL-2 не зависит от реаранжиров-ки гена BCL-2 (t(14:18)(q21;q32)) и является плохим прогностическим фактором [11, 12]. В последние го­ды изучению экспрессии BCL-2 при В-ДККЛ при­дается особое значение в прогностическом плане.

В-клеточная лимфома Ходжкина

Спустя почти 170 лет после первого описания болезни Ходжкина была установлена моноклональ-ная В-клеточная пролиферация опухолевых клеток фолликулярного происхождения, что позволило ввести в классификацию ВОЗ (2001) термин «лим­фома Ходжкина» вместо «болезнь Ходжкина» и «лимфогранулематоз». В классификации ВОЗ (2001) выделено нодулярное лимфоидное преобла­дание, отличающееся по морфологическим, имму­нологическим, генотипическим и клиническим ха­рактеристикам от классических вариантов лимфо­мы Ходжкина: богатого лимфоцитами нодулярного склероза, смешанноклеточного варианта и вариан­та с лимфоидным истощением, объединенных еди­ной биологией опухолевых клеток и единым иммунофенотипом. Опухолевым субстратом при нодулярном лимфоидном преобладании являются L&H-, CD20-положительные клетки. Применение мабтеры при нодулярном лимфоидном преоблада­нии оказалось чрезвычайно перспективным. Для верификации диагноза нодулярного лимфоид-ного преобладания лимфомы Ходжкина с целью дифференциации его с классическими вариантами лимфомы Ходжкина, в частности, с классическим вариантом, богатым лимфоцитами, и целым рядом крупноклеточных лимфом, сходных на светооптическом уровне, необходимо иммуногистохимическое исследование.

Таким образом, морфологическая диагностика чрезвычайно усложнилась благодаря введению в гемопатологию новых вариантов неходжкинских лим­фом и лимфомы Ходжкина. Иммуногистохимиче-ское исследование постепенно становится неотъем­лемой составляющей морфологического диагноза, в частности, позволяет верифицировать варианты лимфом, что необходимо для адекватного лечения онкогематологических заболеваний.

Автор: А.М. Ковригина Отдел патологической анатомии опухолей человека ГУ РОНЦим. Н.Н. Блохина РАМН

"Вместе проти рака.Врачам всех специальностей" №2, 2006 г.

ЛИТЕРАТУРА
1. Horcher M., Souabni A., Busslinger M.Pax 5/BSAP maintains the identity of B cells in late B lymphopoiesis. Immunity 2001;14:779-90.
2. Torlakovic E., Torlakovic G., Nguyen P.L. et al. The value of anti-pax-5 immunostaining in routinely fixed and paraf­ fin-embedded sections: a novel pan pre-B and B-cell marker. Am J Surg Pathol 2002;26:1343-50.
3. Jaffe E.S., Harris N., Vardiman J. et al. WHO Classification of tumors. Tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. Pathology and Genetics. Lyon IARC Press; 2001.
4. Winter J.N., Gascoyne R.D., Besien K.V. Low-grade lymphoma. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2004;:203—20. 5. Swerdlow S.H., Utz G.L.,
5, Williams M.E. Bcl-2 protein in centrocytic lymphoma: a paraffin section study. Leukemia 1993;7:1456-8.
6. Gaulard Ph., Delsol G., Callat M.-P. et al. Cytogenetic and clinicopathologic features of B-cell lymphomas associated with the Burkitt translocation t(14;18)(q24;q32) or its variants. Ann Oncol 2002;13 (Suppl 2):33.
7. Berger F., Traverse-Glehen A., Felman P. et al. Clinicopathologic features of Waldenstrom's macroglobulinemia and mar­ginal zone lymphoma: are they distinct or the same entity? Clin Lymphoma 2005;5:220—4.
8. Berglund M., Thunberg U., Amini R.M. et al. Evaluation of immunophenotype in diffuse B-cell lymphoma and its impact onprognosis. Mod Pathol 2005;18:1113—20.
9. Chang C.-C., McClintock S., Cleveland R. et al. Immunohistochemical expression patterns of germinal center and activation B-cell markers correlate with prognosis in diffuse large B-cell lymphoma. Am J Surg Pathol 2004;28:464-70.
10.Ohshima K., Kawasaki C., Muta H. et al. CD10 and BCL10 expression in diffuse large B-cell lymphoma: CD10 is a marker of improved prognosis. Histopathology 2001;39:156-62.
11.Hermine O., Harionn C., Lepage E. et al. Prognostic significance of bcl-2 protein expression on agressive non-Hodgkin's lym­ phoma (GELA). Blood 1996;87:265-72.
12.Xu Y., McKenna R.W., Doolittle J.E. et al. The t(14;18) in diffuse large B-cell lym­ phoma correlation with germinal center-associated markers and clinical features. Appl Immunohistochem Mol Morphol 2005;13(2):116-23.