Иммуноцитохимическое исследование при раке молочной железы - Вместе против рака
    Главная / Литература / Статьи для специалистов / Рак молочной железы / Иммуноцитохимическое исследование при раке молочной железы

    Иммуноцитохимическое исследование при раке молочной железы

    Дата: 29.12.08

    The paper presents the results of 500 immunocytochemical (ICC) studies of the receptors of estrogens, progesterone, proliferative activ­ity protein, and the oncoprotein C-erB-2 in 150 patients with breast cancer (BC). Receptor expression of estrogen, progesterone, pro­liferative activity protein, and the oncoprotein C-erb-2 was observed in 44, 42, 86, and 54% of cases, respectively. Comparison of the data of ICC and immunohistochemical studies showed that on determining the receptors of estrogen and progesterone, the results agreed in 88.3% of the patients and on determining those of proliferative active protein and the oncoprotein C-erb-2, the results accorded in 83.0 and 93.2%, respectively.

    The use of an ICC study makes it possible to extend the capabilities of current morphological studies, to assess prognostic factors before surgery, and to determine sensitivity to chemohormonal treatment.

    За последние годы достигнут значительный прогресс в клиническом использовании различ­ных биологических маркеров. В их числе онкоге­ны, рецепторы эстрогенов (РЭ) и прогестерона (РП), маркеры апоптоза, рецепторы факторов роста и т. д. Все эти показатели позволяют более детально изучить молекулярно-биологические особенности злокачественных опухолей, ассоци­ируются со степенью дифференцировки, способ­ностью к инвазии и метастазированию, чувстви­тельностью к химиотерапии, а следовательно, с особенностями течения и прогнозом заболева­ния в каждом конкретном случае [1—3]. В насто­ящее время имеется несколько сотен различных моно- и поликлональных антител, выявляющих экспрессию тех или иных белков, связанных со структурными компонентами клетки, продукта­ми клеточного синтеза (гормонов, ферментов, иммуноглобулинов), рецепторами и т. д. Однако наивно полагать, что с помощью антител можно прямо идентифицировать раковые клетки, ско­рее антитела лишь указывают на изменения кар­тины генной экспрессии [4]. В связи с этим особое значение приобретает изучение клинического течения, лечения, гормо­нального статуса и факторов прогноза при раке молочной железы (РМЖ), эндометрия, легкого, толстой кишки и т.д. Экспрессия онкобелков се­мейства C-erbB-2, различных маркеров апоптоза — bcl-2, bcl-x, p-53, CD-95 и др., а также показате­ли пролиферативной активности опухолевых клеток Ki-67, PCNA коррелируют с исходом за­болевания, т.е. выживаемостью и вероятностью возникновения рецидива у пациента [5]. У боль­ных распространенным РМЖ особенно актуаль­ным является определение гормональной и лекарственной чувствительности опухолей для ин­дивидуального подбора схем терапии [6—9]. Луч­шие результаты эндокринной терапии РМЖ достигаются при РЭ+- и РП+-статусе, чем при дру­гих вариантах рецепторного фенотипа [10]. По­ложительные результаты лечения получены у 77% больных с наличием экспрессии в опухоле­вых клетках обоих рецепторов, при этом 5-лет­няя безрецидивная выживаемость возросла на 20—30% [11]. Рецепторположительные опухоли молочной железы имеют более высокую дифференцировку и более благоприятное клиническое течение [5, 12, 13]. Эффективность гормонотера­пии составила 27% при опухолях с РЭ+ и РП- и 46 % при статусе РЭ- и РП+. При статусе РЭ- и РП- адекватный ответ на лечение наблюдали в 10—15% случаев соответственно [11]. В практи­ческих целях для установления положительного гормонального статуса опухоли достаточно иметь 5—10% четко окрашенных клеток [5].

    В настоящее время в клиниках и лаборато­риях используется большой арсенал диагности­ческих методик. Так, для определения гормо­нального статуса опухолей молочных желез в равной мере используются три метода: радиолигандный, иммуноферментный и иммуногистохимический (ИГХ). Первые два метода — биохими­ческие, основанные на реакции связывания лиганда в гомогенате (цитозоле) опухолевых кле­ток, позволяют количественно оценить рецепторный статус, тогда как ИГХ-метод определяет принадлежность гормонорецепторов именно к опухолевым клеткам, что практически невоз­можно при биохимических исследованиях [5, 12, 14]. ИГХ-исследование, широко применяемое в клинической практике, также имеет ряд недос­татков, среди которых основными являются по­теря и маскировка антигена при приготовлении препаратов, а также более длительное время оп­ределения молекулярных маркеров. В качестве альтернативы ИГХ-методу все больший практи­ческий интерес приобретает метод определения


    Рис. 1. Слабая экспрессия белка пролиферативной активности Ki-67 в клетках РМЖ, х 100


    Рис. 2.Умеренная экспрессия РЭ в клетках РМЖ, х 400.


    Рис. 3. Выраженная экспрессия онкопротеина C-erbB-2 в клетках РМЖ, х 400


    Рис. 4. Слабая экспрессия РП в клетках РМЖ, х 100

    экспрессии молекулярных маркеров на клеточ­ном уровне — иммуноцитохимический (ИЦХ) [15]. Тот факт, что пункционная биопсия более простая, малотравматичная процедура, практи­чески не сопровождающаяся осложнениями, по­зволяющая получить достаточное количество клеточного материала для ИЦХ-исследования, говорит о неоспоримых преимуществах ИЦХ. Иммуноцитохимия не требует больших времен­ных затрат, выполняется быстро в течение 2—3 ч. Замечено, что мембранные и цитоплазматические маркеры чаще положительно окрашиваются в цитологических, чем в гистологических препаратах. Возможно, это связано с более щадящей обработкой цитопрепаратов, отсутствием потери и маскировки антигенов при проводке и депарафинизации материала с использованием агрес­сивных химических реагентов, что негативно сказывается на мембранных и цитоплазматических рецепторах [15, 16].

    Иногда возможности ИЦХ-метода ограничиваются плохим качеством мазков или малым количеством клеток в цитопрепаратах [15, 17]. Для решения этой проблемы на сегодняшний день широко используются так называемые жидкостные системы, когда пунктаты, полученные под контролем УЗИ, вносят в специальную среду накопления и затем центри­фугируют ее для концентрации малого количест­ва клеток в одном миниполе на стекле. Многие авторы отмечают большие преимущества таких препаратов: клетки располагаются в монослое, сохраняется их архитектоника, уменьшаются фон и количество элементов крови, концентра­ция клеток в одном месте значительно экономит дорогие сыворотки, улучшается качество резуль­татов ИЦХ-исследования [17—20].

    Сопоставление результатов экспрессии мо­лекулярных маркеров при ИЦХ- и ИГХ-методах проводилось рядом исследователей [21, 22]. Полу­чена хорошая корреляция: совпадение результа­тов ИЦХ- и ИГХ-исследований составило от 61 до 92% [22-27].

    Цель настоящей работы — определить воз­можности ИЦХ-метода в оценке некоторых прогностических факторов РМЖ на дооперационном этапе.

    Таблица 1. Частота и характер экспрессии РЭ, РП, Кi-67 и белка пролиферативной активностионкопротеина C-erbB-2 при РМЖ


    Таблица 2. Анализ совпадений и несовпадений результатов ИЦХ- и ИГХ -исследования



    Выполнено 500 ИЦХ-исследований материа­ла, полученного от 150 больных. Все ИЦХ-исследования проводили на дооперационном этапе с це­лью уточняющей диагностики и назначения неоадъювантной химиогормонотерапии. В работе были использованы моноклональные кроличьи и мышиные антитела (DAKO): к рецепторам эстроге­нов (клон 1D5, разведение 1:35), к рецепторам про­гестерона (клон 636, разведение 1:50), к белку про­лиферативной активности Ki—67( клон MiB-1, разведение 1:50—1:75), онкопротеину C-erbB-2 (разведение 1:250—1:350). Для визуализации им­мунной реакции использовали систему LSAB+ Detection System (DAKO) согласно инструкции, пероксидазную активность выявляли с помощью 3,3-диаминобензидина (DAB), цитопрепараты до­крашивали гематоксилином Майера и заключали в бальзам. Реакции проводили на цитологических монослойных мазках, полученных при накоплении пунктатов в специальной питательной среде с пос­ледующим центрифугированием на системе «Cytospin-3» в режиме 1000 об/мин в течение 5 мин.

    Антитела к РЭ и РП использовали в 150 ис­следованиях. Для изучения факторов прогноза анализировали экспрессию белка пролифератив­ной активности Ki-67 и онкопротеина C-erbB-2 у 100 пациенток. Подсчет иммунопозитивных кле­ток проводили в областях с максимальным прояв­лением диаминобензидина на 200—300 опухоле­вых клеток на микроскопе «Axioskop» (OPTON, West Germany). Экспрессию с антителами к РЭ, РП и белку пролиферативной активности Ki—67 оценивали как положительную при интенсивном темно-коричневом окрашивании ядер, реакцию с антителами к C-erbB-2 отмечали при четком окра­шивании мембран в опухолевых клетках. Резуль­таты считались отрицательными при полном от­сутствии или экспрессии антигена менее чем в 5%, слабо положительными — при реакции в 5—24%, умеренно положительными — в 25—74% опухоле­вых клеток, выраженная реакция отмечалась при экспрессии антигена более чем в 75% раковых клеток (рис. 1—4).

    При оценке гормонального статуса карци­ном молочной железы ИЦХ-методом положи­тельная экспрессия РЭ была выявлена в 44% (66) исследований, РП — в 42% (63), пролиферативная активность с антителами Ki-67 отмечена в 86%, экспрессия онкопротеина C-erbB-2 — в 54% ис­следований (табл. 1). Сопоставление данных ИЦХ- и ИГХ-исследования у 60 больных РМЖ показало совпадение результатов при определении РЭ и РП в 88,3% случаев (табл. 2). Процент совпадений и несовпадений резуль­татов определения экспрессии РП при ИЦХ- и ИГХ-исследованиях мало чем отличался от тако­вого при экспрессии РЭ (см. табл. 2). Расхожде­ния в результатах ИЦХ- и ИГХ-исследований рецепторного статуса при РМЖ объясняются гете­рогенностью опухоли.

    Расхождение результатов определения экс­прессии Ki-67 ИЦХ- и ИГХ-методами было наи­более значимым по сравнению с другими марке­рами и составило 17%, причем в 9 случаях резуль­таты были положительными при ИГХ- и отрица­тельными — при ИЦХ-исследовании. Только в одном наблюдении экспрессия белка Ki-67 выявлялась ИЦХ- и не выявлялась ИГХ-методом, что объясняется асинхронностью митотической ак­тивности в опухолевых клетках и, как следствие, значительным разбросом в значениях индекса Ki-67 в пределах одной опухоли. Высокий процент совпадений — 93,2% (55) исследований ИЦХ- и ИГХ-исследований на­блюдался при анализе экспрессии онкопротеина C-erbB-2 (см. табл. 2).

    Результаты нашего исследования свидетель­ствуют о больших возможностях ИЦХ-метода в предоперационной диагностике и оценке некото­рых факторов прогноза течения опухолевого про­цесса. Возможность до начало лечения определить рецепторный статус опухоли и важнейшие факторы, влияющие на прогноз и разработку схем химиотерапии, позволяет адекватно спланировать лечение до получения гистологического заключе­ния. Между результатами ИЦХ- и ИГХ-исследо­ваний прослеживаются четкие корреляции: доля совпадений составляет от 83 до 93%.

    Таким образом, использование ИЦХ-метода позволяет расширить возможности современных морфологических методов исследования и на дооперационном этапе оценить прогностические факторы, выявить агрессивные свойства опухоли и прогнозировать чувствительность к химиогормональному лечению.

    Авторы: Н.Н. Волченко, М.В. Савостикова Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена
    IMMUNOCYTOCHEMICAL STUDY IN BREAST CANCER
    N.N. Volchenko, M. V. Savostikova P.A. Herzen Moscow Research Oncological Institute

    Материал взят из журнала "Маммология", №4, 2006


    ЛИТЕРАТУРА:

    1. Зборовская И.Б., Ельчева И.А., Татосян А. Г. Новое в терапии рака молочной железы. Под ред. Н.И. Переводчиковой. М., 1998. с. 11—8.
    2 Казанцева И.А., Федосенко А.К., Гуревич Л.Е. Иммуноцитохимические исследования в дифференциальной диагностике доброкачественных и злокачественных поражений щитовидной железы. Арх патол 2001; 4:18.
    3. Gasparini G., Pozza F., Harris A.L. Evaluating the potential usefulness of new prognostic and predictive indicators in node-negative breast cancer patients. J Natl Cancer Inst 1993;85(15):1206-19.
    4. Cемиглазов В.Ф. Карцинома in situ молочной железы — морфологические и клинические проблемы. Практич онкол 2002;3(1):60-8.
    5. Петров С.В. Иммуногистохимическая диагностика опухолей щитовидной железы, матки, яичников, яичек. В кн.: Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. Казань, РИЦ «Титул»; 2000. с. 72.
    6. Петров С.В., Райхлин Н.Т. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. Казань, 2000. с. 13-4.
    7. Cooper L.S., Gillett C.E., Patel N.K. et al. Survival premenopausal breast car­cinoma patients in relation to menstrual cycle timing of surgery and estrogen receptor/progesterone receptor status of the primary tumor. Cancer
    1999;86(10):2053-8.
    8. Elisei R., PincheraA., Romei С etal. Expression of thyrotropin receptor (TSH-R), thyroglobulin, thyroperoxi-dase, and calcitonin messenger ribonucleic acids in thyroid carcinomas: evi­dence of the TSH-R gene transcript in
    medullary histotype. J Clin Endocrinol Metab 1994;78(4):867—71.
    9. Guiter G.E., Gatscha R.M., Zakowski M.F. ThinPreRpvs. conven­tional smears in fine-needle aspirations of sarcomas: A morphological and immunocytochemical study. Diagn Cytopathol 1999;21(5):351-4.
    10. Bozzetti C., Nizzoli R., Naldi N. et al. Fine-needle aspiration technigue for the concurrent immunocytochemical evalua­tion of multiple biologic parameters in primary breast carcinoma. Breast Cancer Res Treat 1994;32;221-8.
    11. Трапезников Н.Н., Аксель Е.М. Статистика рака молочной железы. В кн.: Новое в терапии рака молочной железы. М., 1998. с. 6—10.
    12. Герштейн Е.С., Кушлинский Н.Е. Тканевые маркеры как факторы прогноза при раке молочной железы. Практич онкол 2002;3(1):38—44.
    13. Пожарисский К.М., Леенман Е.Е. Значение иммуногистохимических методик для определения характера лечения и прогноза опухолевых заболеваний. Арх патол 2000; 62(5): 3-11.
    14. Bai H., Sung C.J., Steinhoff M.M. ThinPrepR Pap Test promotes detection of glandular lesions of the endocervix. Diagn Cytopathol 2000;23(1):19-22.
    15. Глухова Е.И. Экспрессия белков, контролирующих апоптоз, при раке молочной железы. Автореф. дис. ... канд. мед. наук. М., 2003.
    16. Глузман Д.Ф., Скляренко Л.М., Надгорная В.А., Крячок И.А. Диагностическая иммуноцитохимия опухолей. Киев, Морион; 2003. с. 28—31.
    17. Волченко Н.Н., Савостикова М.В. Опыт применения иммуноцитохимического исследования в онкологической практике. Новые диагностические и лечебные технологии в онкологии. Томск, 2003.
    18 Хериет Э.Р., Гаттер К.С. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. Под ред. С. Херрингтона и Дж. Макги. М., Мир; 1999. с. 20-1.
    19. Gasparini G., Toffoli G., Berlanda G., Rossi С A pharmacological rationale for neoadjuvant chemotherapy with adriamycin in locally advanced breast cancer. Anticancer Res 1990;10(1):193—6.
    20. Ozaki O., Ito K., Mimura T. et al. Anaplastic transformation of papillary thyroid carcinoma in recurrent disease in regional lymph nodes: a histologic and immunochemical study. J Surg Oncol 1999;70(1):45-8.
    21. Allred D.C., Harvey J.M., Berardo M., Clark G.M. Prognostic and predictive factors in breast cancer by immunohisto-chemical analysis. Mod Pathol 1998;11(2):155-68.
    22. Makris A., Allred D.C., Powles T.J. et al. Cytological evaluation of biological prognostic markers from primary breast carcinomas. Breast Cancer Res Treat 1997;44:65-74.
    23. Gown A.M. Diagnostic immunocytochemistry: manual. Seattle, Pheno Path, 1999.
    24. Harris L.N., LiotchevaV., Broadwater G. et al. Proc. ASCO. 1999;18: abstr. 407.
    25. Droese M. Aspiration Cytology of the Thyroid. Atlas and Manual. Stuttgart, N Y, 1995. p. 256.
    26. Nizzoli R., Bozzetti C., Naldi N. et al. Comparison of the results of immunocytochemical assays for biologic variables on preoperative fine-needle aspirates and on surgical specimens of primary breast carcinomas. Cancer
    Cytopathol 2000;90:61—6.
    27. Nizzoli R., Bozzetti C., Savoldi L. et al. Immunocytochemical assay of estrogen and progesterone receptors in fine needle aspirates from breast cancer patients. Acta Cytol 1994;38:933-8.
    28. McGuire W.L. Hormone receptors: their role in predicting prognosis and response to endocrine therapy. Semin Oncol 1978;5:428-33.