Параметры ДНК-проточной цитофлюорометрии у больных местно-распространенным раком молочной железы - Вместе против рака
    Главная / Литература / Статьи для специалистов / Рак молочной железы / Параметры ДНК-проточной цитофлюорометрии у больных местно-распространенным раком молочной железы

    Параметры ДНК-проточной цитофлюорометрии у больных местно-распространенным раком молочной железы

    Дата: 29.12.08

    The authors studied the results of an investigation of the criteria (proliferative activity, the count of cells in different phases of a cel­lular cycle) for DNA flow cytofluorometry and their correlation with an individual prognosis of the disease in 215 patients with local­ly advanced breast cancer. All the patients received various complex therapies. The material was investigated either before special therapy (prior to the neoadjuv ant stage) or after surgery. Analysis of the findings showed that overall 5-year and relapse-free survival significantly correlated with the ploidy and count of cells in the S phase of a cellular cycle. There was a regularity of the progress of the disease, the significant deterioration of its prognosis, and a reduction in the values of DNA flow cytofluorometry.

    Риск умереть от рака молочной железы (РМЖ) зависит, с одной стороны, от стадии за­болевания на момент диагноза, а с другой — от биологических особенностей развития опухо­левого процесса, в том числе скорости роста, способности опухоли к метастазированию, осо­бенностей метастазирования, а также чувстви­тельности опухоли к проводимому лечению. Факторы прогноза течения заболевания интен­сивно изучаются при ранних стадиях РМЖ. Очевидно, что некоторые из них важны для всех стадий заболевания и сохраняют свое зна­чение в процессе его развития от локального до генерализованного.

    В течение последних двух десятилетий в отечественной и зарубежной литературе появи­лось большое количество научных работ, связан­ных с изучением возможностей количественных методов исследования клетки - морфометрией и ДНК-проточной цитофлюорометрией.

    В литературе существует много данных о том, что наличие анеуплоидной опухоли свиде­тельствует о менее благоприятном прогнозе те­чения заболевания [1—3].Однако в некоторых работах авторы не смогли отметить прогностического значения плоидности первичной опухоли [4—9], а по дру­гим данным, плоидность опухоли имела про­гностическое значение только в группе больных с метастазами в лимфатических узлах [10].

    Многие исследователи отмечают связь ме­жду увеличением числа клеток в S-фазе клеточ­ного цикла и повышенным риском возврата за­болевания и смертностью больных [1, 7, 11 —14]. Так, по данным ряда авторов, процент клеток в S-фазе клеточного цикла является прогностическим фактором для общей и безрецидивной вы­живаемости, уступающим по значимости только статусу лимфатических узлов [15—17]. Некоторые исследования указывают на то, что пролиферативная активность, особенно в комбинации с плоидностью опухоли, может дать больше прогностически значимой инфор­мации, чем только плоидность опухоли [18—20]. Кроме того, по данным P. Hupperts и соавт. [21], комбинация количества клеток в S-фазе клеточ­ного цикла и процента анеуплоидных клеток в опухоли является важным фактором прогноза как для общей, так и для безрецидивной выжи­ваемости у больных с I и II стадиями РМЖ. В то же время, по сведениям некоторых авторов, количество клеток в S-фазе клеточно­го цикла не имеет прогностического значения [5, 6, 8]. По другим данным, этот показатель имеет значение для безрецидивной выживае­мости, но не влияет на общую выживаемость [4]. По данным S.B. Ewers и соавт. [16], количе­ство клеток в S-фазе клеточного цикла имеет прогностическое значение для безрецидивной выживаемости только при отсутствии пораже­ния регионарных лимфатических узлов или при поражении 1—3 лимфатических узлов.

    Кроме того, в литературе имеются сведе­ния о том, что при проведении адъювантной хи­миотерапии у больных с поражением регионар­ных лимфатических узлов ни плоидность, ни процент клеток в S-фазе клеточного цикла не имеют прогностического значения [22]. Многие авторы отмечают корреляцию па­раметров ДНК-проточной цитофлюорометрии между собой, а также с другими важными про­гностическими факторами.

    Таблица 1. Зависимость числа клеток в S-фазе и ИП от числа пораженных лимфатических узлов


    Так, количество клеток в S-фазе клеточно­го цикла изменяется значительно в зависимости от плоидности опухоли. При этом в анеуплоид­ных опухолях данный показатель значительно выше, чем в диплоидных [1, 2, 4, 6, 15]. Кроме того, отмечается увеличение индекса пролифе­рации (ИП; S+G2+M) в анеуплоидных опухо­лях по сравнению с диплоидными [1, 23].


    По некоторым данным, существует зави­симость между степенью поражения регионар­ных лимфатических узлов и плоидностью пер­вичной опухоли. По данным D.W. Hedley и со-авт. [18], наличие анеуплоидной опухоли кор­релировало с поражением четырех и более аксиллярных лимфатических узлов. Эти резуль­таты подтверждают и другие авторы, отмечая увеличение числа анеуплоидных опухолей при увеличении количества пораженных лимфати­ческих узлов [5, 21, 24]. Однако, по данным других авторов, не существует связи между плоидностью опухоли и статусом лимфатиче­ских узлов [25]. В большинстве работ авторы изучали про­гностическое значение параметров ДНК-про­точной цитофлюорометрии у больных ранним РМЖ. Целью нашего исследования было изуче­ние прогностического значения этих парамет­ров у больных с местно-распространенным про­цессом (III стадия заболевания). 215 больных местно-распространенным РМЖ (МРРМЖ) были включены в наше исследование. Плоидность клеток опухоли, процент кле­ток в S-фазе клеточного цикла, ИП, процент анеуплоидных клеток изучали в образцах трепанобиопсии у больных, получавших предопера­ционное лечение, или в операционном материа­ле, если предоперационное лечение не проводи­лось. Клеточную суспензию, окрашенную флюорохромом, исследовали на проточном анализа­торе FACScan (Beckton Dickinson, США) с лазерным источником излучения. В каждом об­разце изучалось не менее 25 000 клеток.

    На основании показателей флюоресцен­ции окрашенных ядер прибор строил ДНК-гис­тограммы. Для анализа гистограмм использова­лась стандартная программа Multicycle (Phoenix Flow System, США, 1994). В полученной ДНК-гистограмме количество клеток в различных фа­зах клеточного цикла (G0/1, S, G2+M) вычислялось по отношению к общему числу исследо­ванных клеток. ИП в опухоли соответствовал проценту клеток в S- и G2+M-фазах клеточного цикла.

    При оценке плоидности опухоли рассчиты­вали индекс ДНК (ИДНК), который характери­зовал отношение интенсивности флюоресцен­ции пика анеуплоидных клеток к диплоидному. Диплоидными опухолями считали те, у которых пик G0/1 находился в пределах контрольного пика диплоидных стандартов (был равен 1,0). В анеуплоидных опухолях он был больше или меньше 1,0. Из 215 пациенток 96 (44,7%) имели дип­лоидные опухоли и 119 (55,3%) — анеуплоидные. В группе больных с анеуплоидными опу­холями в 61 (51,3%) случае доля анеуплоидных клеток в опухоли составила до 50% и в 58 (48,7%) - более 50%.

    При анализе числа S-фазных клеток и ИП в зависимости от плоидности первичной опухоли мы установили, что в группе анеуплоидных опу­холей эти показатели были достоверно выше, чем в группе диплоидных опухолей 10,51±0,5 и 25,77±1,07% против 5,94±0,27 и 16,17±0,62% соответственно (p=0,000000). Нами была выявлена достоверная корреля­ция между степенью поражения регионарных лимфатических узлов и плоидностью первичной опухоли. Процент анеуплоидных опухолей воз­растает при увеличении числа пораженных лим­фатических узлов. Так, в группе больных с от­сутствием вовлечения регионарных лимфатиче­ских узлов доля анеуплоидных опухолей соста­вила 34,6%, при поражении 1—3 лимфатических узлов — 48,2%, при поражении более 4 лимфа­тических узлов — 73,5%.

    Кроме того, мы отметили явную тенден­цию увеличения ИП и числа S-фазных клеток в опухоли при увеличении числа пораженных лимфатических узлов (табл. 1).

    В зависимости от количества клеток в S-фазе клеточного цикла мы выделили следующие 3 группы больных: пациентки с числом клеток < 7% - 111 (51,6%), > 7 и < 14% - 69 (32,1%) и > 14% — 35 (16,3%). При этом следует отметить, что в группе больных с количеством клеток в S-фазе клеточного цикла > 14% не было диплоид­ных опухолей.

    Таблица 2. Показатели общей и безрецидивной выживаемости больных МРРМЖ с анеуплоидными и диплоидными новообразованиями

    Таблица 3 . Показатели общей и безрецидивной выживаемости больных МРРМЖ в зависимости от плоидности опухоли

    Нами была проведена оценка отдаленных результатов лечения больных МРРМЖ в зави­симости от различных параметров ДНК-про­точной цитофлюорометрии. Показатели об­щей и безрецидивной выживаемости оказа­лись достоверно лучше при наличии диплоид­ных опухолей (табл. 2).

    Группа анеуплоидных опухолей достаточно разнообразна в плане прогноза, поэтому разные авторы предлагают варианты их классификации в зависимости от значения ИДНК и показателей пролиферативной активности [1, 18]. Так, выде­ляются группы анеуплоидных опухолей с ИДНК 1,1 — 1,84 в пределах митотического цикла. В на­шем случае 96 (80,8%) пациенток составляют эту группу. Кроме того, у 13 (10,9%) больных выявлены тетраплоидные опухоли с ИДНК 1,85—2,15, которые, по данным литературы, имеют относительно благоприятный прогноз [1, 26]. Существуют варианты анеуплоидных опухолей, отличающихся наиболее неблагопри­ятным течением. Среди них в нашем исследова­нии можно выделить анеуплоидные многоклоновые опухоли, имеющие несколько анеупло­идных клонов с разными значениями ИДНК — у 7 (5,8%) пациенток, а также гиперанеуплоидные опухоли со значением ИДНК > 2,15 — у 3 (2,5%) больных.

    В связи с небольшим количеством наблю­дений в подгруппах больных с анеуплоидными многоклоновыми и гиперанеуплоидными опу­холями мы не смогли достоверно оценить отда­ленные результаты. В то же время следует отме­тить, что из 7 пациенток с анеуплоидными мно­гоклоновыми опухолями у 6 (85,7%) были зафи­ксированы рецидивы заболевания за 4-летний период наблюдения. Кроме того, 5 (71,4%) из них умерли в течение первых 5 лет от начала ле­чения, что действительно может указывать на очень плохой прогноз у этих больных. Из 3 пациенток с гиперанеуплоидными опухолями у 2 отмечены рецидивы заболевания за 5-летний период; одна больная умерла на 4-м, другая — на 7-м году наблюдения. Отдаленные результаты в группах боль­ных с анеуплоидией в пределах митотического цикла и с тетраплоидными опухолями пред­ставлены в табл. 3.

    Сравнение двух групп больных показало, что в группе больных с тетраплоидными опухо­лями безрецидивная и общая выживаемость до­стоверно лучше, чем в группе пациенток с анеу­плоидными опухолями с ИДНК 1,1 — 1,84. В то же время общая выживаемость в группе боль­ных с диплоидными опухолями достоверно вы­ше, чем при наличии тетраплоидной опухоли лишь за 5-летний период наблюдения (см. табл. 3). Показатели безрецидивной выживаемости дос­товерно не различались. Полученные данные свидетельствуют о том, что тетраплоидные опу­холи имеют наиболее благоприятный прогноз в группе анеуплоидных опухолей.

    Это можно объяснить тем, что тетраплоид­ные опухоли имеют ИДНК, приближенный к таковому нормальных клеток, находящихся в стадии деления.

    Для определения групп больных, имеющих наименее благоприятный прогноз в плане вы­живаемости, мы выделили подтипы анеуплоид­ных опухолей с разным числом анеуплоидных клеток. Все пациентки с анеуплоидными опухо­лями были разделены на 2 группы: в 1 -й группе содержание анеуплоидных клеток было до 50 %, во второй — более 50 %.

    Таблица 4. Показатели выживаемости больных МРРМЖ в зависимости от числа клеток в S-фазе клеточного цикла


    Сравнение отдаленных результатов в груп­пах показало достоверные преимущества по по­казателям как общей (р=0,0083), так и безреци­дивной выживаемости (р=0,01436) в группе па­циенток, имеющих опухоли с содержанием анеуплоидных клеток до 50%. При этом 5- и 10-лет­няя безрецидивная выживаемость у пациенток 1-й группы составила 38,91±6,51 и 23,88±6,94%, а общая выживаемость — 63,81±6,52 и 36,97±8,87% соответственно. Соответствующие показатели во 2-й группе составили 21,8±5,63 и 11,77±4,84% и 33,09±6,68 и 18,29±5,88%. Таким образом, увеличение доли анеуплоидных клеток в анеуплоидной опухоли еще более ухудшает прогноз заболевания. Мы провели анализ отдаленных результа­тов лечения больных МРРМЖ в зависимости от количества клеток в S-фазе клеточного цикла. При этом больные были разделены на группы, как указывалось выше (табл. 4). Сравнение показателей общей и безреци­дивной выживаемости выявило достоверные пре­имущества в группе больных с числом клеток, на­ходящихся в S-фазе клеточного цикла, до 7% по сравнению с двумя другими группами (р < 0,01).

    Кроме того, увеличение количества клеток более 14% приводит к достоверному ухудшению общей и безрецидивной выживаемости по сравне­нию с группой больных, имеющих опухоли с со­держанием S-фазных клеток >7 — < 14% (р<0,01). Чтобы оценить влияние параметров пролиферативной активности при диплоидных и ане­уплоидных опухолях, которые значимо различа­ются в плане отдаленных результатов лечения, и выделить среди них подгруппы с наихудшим прогнозом, мы сравнили показатели выживае­мости в зависимости от количества S-фазных клеток. В группе больных с диплоидными опу­холями 76 пациенток имели количество клеток в S-фазе <7%и20- >7и< 14%.

    Ни у одной больной, как указывалось вы­ше, количество S-фазных клеток не превышало 14%. Сравнение отдаленных результатов лече­ния показало, что как общая (р=0,0046), так и безрецидивная (р=0,0058) выживаемость была достоверно лучше в группе больных, имеющих диплоидные опухоли с содержанием S-фазных клеток <7% (см. рисунок).

    Рис.1. Безрецидивная (а) и общая (б) выживаемость больных МРРМЖ, имеющих диплоидные опухоли, в зависимости от числа S-фазных клеток. * p < 0,01 по сравнению с пациентками, имеющими >7—414% клеток в S-фазе


    Группа пациенток с анеуплоидными опухоля­ми (119 человек) была также разделена в зависимо­сти от количества S-фазных клеток и ИП опухоли. При этом 5-летняя общая выживаемость в группах больных с количеством S-фазных кле­ток <7 %, >7 — <14% и >14% составляла 79,05±7,06, 42,39±7,87 и 22,4±7,34%, безреци­дивная - 61,37±8,43, 20,86±6,06 и 10,81±5,63% соответственно. Сравнение показателей общей и безреци­дивной выживаемости выявило высокодостовер­ные различия между всеми тремя группами за весь период наблюдения — в среднем 13 лет (p<0,01). Прослеживается явное преимущество выживаемости у больных с меньшим содержани­ем клеток в S-фазе клеточного цикла.

    Таким образом, проведенный нами ана­лиз показал высокую информативность в плане прогноза течения заболевания у больных МРРМЖ параметров ДНК-проточной цитофлюорометрии — плоидности опухоли, процен­та анеуплоидных клеток в опухоли, а также числа клеток в S-фазе клеточного цикла. При этом последний показатель сохраняет свое прогностическое значение в группе как дип­лоидных, так и анеуплоидных опухолей и мо­жет использоваться для выделения групп больных, имеющих более агрессивное течение заболевания и, вероятно, требующих других подходов к лечению.


    Авторы: М.В. Шомова, В.Н. Богатырев, В.П. Летягин ГУЗ Областной клинический онкологический диспансер, Рязань; ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
    PARAMETERS OF DNA FLOW CYTOFLUOROMETRY IN PATIENTS WITH LOCALLY ADVANCED BREAST CANCER
    M. V. Shomova, V.N. Bogatyrev, V.P. Letyagin
    Regional Clinical Cancer Dispensary, Ryazan; N.N.Blokhin Russian Cancer Research Center, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow

    Материал взят из журнала "Маммология", №4, 2006


    ЛИТЕРАТУРА:

    1. Богатырев В.Н. Значение количе­ственных методов исследования (морфометрии, проточной цитофлюорометрии, сканирующей микрофотометрии) в клинической онкоцитологии: Автореф. дис. ... докт. мед. на­ ук. М., 1991.
    2. Clark G.M., Dressler L.G., Owens M.A. et al. DNA flow cytometry pre­dicts time to recurrence and survaval in 606 axillary node-negative breast cancer patients (meeting abstract). Proc Annu Meet Am Soc Clin Oncol 1988;7:abstr. 52.
    3. Pinto A.E., Andre S., Nogueira M. et al. Flow cytometric DNA hypertetraploidy is associated with unfavourable prognostic features in breast cancer. J Clin Pathol 1997;50(7):591-5.
    4. Kaufmann M., Feichter G.E., Nhila A. et al. [Flow cytometry parameters, hormone receptors and axillary lymph node status as prognostic factors in pri­mary breast cancer]. Geburtshilfe Frauenheilkd 1988;48(10):705-9.
    5 Pfisterer J., Kommoss F., Sauerbrei W. et al. DNA flow cytometry in node-posi­tive breast cancer. Prognostic value and correlation with morphologic and clini­cal factors. Anal Quant Cytol Histol 1995;17(6):406-12.
    6. Prasad A.R., Divine G., Zarbo R.J. Two-color, cytokeratin-labeled dna flow cytometric analysis of 332 breast cancers: lack of prognostic value with 12-year fol­low-up. Arch Pathol Lab Med 2001;125(3):364—74.
    7. Russo A., Bazan V., MorelloV. et al. Vimentin expression, proliferating cell nuclear antigen and flow cytometric factors. Prognostic role in breast cancer. Analyt Quant Cytol Histol 1994;16:365-74.
    8. Stanton P.D., Cooke T.G., Oakes S.J. et al. Lack of prognostic significance of DNA ploidy and S-phase fraction in breast cancer. Br J Cancer 1992;66(5):925-9.
    9. Wong S.W., Rangan A.M., Bilous A.M. et al. The value of S-phase and DNA ploidy analysis as prognostic mark­ers for node-negative breast cancer in the Australian setting. Pathology 1999;31(2):90-4.
    10. Utada Y., Yoshimoto M., Kasumi F. et al. [Relationship between DNA ploidy and survival in breast cancer]. Gan To Kagaku Ryoho 1998;25(Suppl 3):431—5.
    11. Chassevent A., Jourdan M.L., Romain S. et al . S-phase fraction and DNA ploidy in 633 T1T2 breast cancers: a standardized flow cytometric study. Clin Cancer Res 2001;7(4):909-17.
    12. Chevillard S., Lebeau J., Pouillart P. et al. Biological and clinical significance of concurrent p53 gene alterations, MDR1 gene expression, and S-phase fraction analyses in breast cancer patients treated with primary chemotherapy or radiotherapy. Clin Cancer Res 1997;3 (12 Pt 1):2471-8.
    13. Jones S., Clark G., Koleszar S. et al. Low proliferative rate of invasive nodenegative breast cancer predicts for a favorable outcome: a prospective evalua­tion of 669 patients. Breast Cancer 2001;1(4):310-4.
    14. Vielh P., Carton M., Padoy E. et al. S-phase fraction as an independent prog­nostic factor of long-term overall survival in patients with early-stage or locally advanced invasive breast carcinoma. Cancer 2005;105(6):476-82.
    15. Сamplejohn R.S., Ash C.M., Gillet C.E. et al. The prognostic significance of DNA flow cytometry in breast can­cer: results from 881 patients treated in a single centre. Br J Cancer 1995;71(1):140-5.
    16. Ewers S.B., Attewell R., Baldetorp B. et al. Prognostic potential of flow cytometric S-phase and ploidy prospectively determined inprimary breast carci­nomas. Breast Cancer Res Treat 1992;20(2):93-108.
    17. Largillier R., Namer M., Ramaioli A. et al. Prognostic value of S-phase frac­tion in 920 breast cancer patients: focuson T1N0 status. Int J Biol Markers 2003:18(4):273-9.
    18. Hedley D.W., Rugg C.A., Gelber R.D. Association of DNA index and S-phase fraction with prognosis of nodes positive early breast cancer. Cancer Res 1987;47:4729-35.
    19. Joensuu H., Toikkanen S., Klemi P.J.DNA index and S-phase fraction and their combination as prognostic factors in operable ductal breast carcinomas. Cancer 1990;66:331-40.
    20. Moureau-Zabotto L., Bouchet C., Cesari D. et al. Combined flow cytome­try determination of S-phase fraction and DNA ploidy is an independent prog­nostic factor in node-negative invasive breast carcinoma: analysis of a series of 271 patients with stage I and II breast cancer. Breast Cancer Res Treat 2005;91(1):61-71.
    21. Hupperts P., Blijham G., Volovics L. et al. The prognostic value of flow cytometry (FCM) in node-positive breast cancer patients. Proc Annu Meet Am Soc Clin Oncol 1994;13:abstr. 147.
    22. Witzig T.E., Ingle J.N., Schaid D.J. et al. DNA ploidy and percent S-phase as prognostic factors in node-positive breast cancer: Results from patients enrolled in two procpective randomized trials. J Clin Oncol 1993;11(2):351-9.
    23. Ostrowski M.L., Chakraboty S., Laucirica R. et al. Quantitative Image Analysis of MIB-1 Immunoreactivity. A comparison with flow cytometric assess­ment of proliferative activity in invasive carcinoma of the breast. Analyt Quant Cytol Histol 1995;17:15-24.
    24. Uzarevic B., Petrovecki M., Marusic M et al. Prognostic significance of cell cycle parameters in infiltrative ductal breast carcinoma. J Clin Lab Anal 1998;12(3):131-6.
    25. Machado-Santelli G.M., Mori L., Pereira C.A. Prediction of relapse in patients with breast cancer by DNA cytometry. Anal Cell Pathol 1994;7(4):321-34.
    26. Baildam A.D., Zaloudik J., Howell A. DNA analysis by flow cytometry, response to endocrine treatment and prognosis in advanced carcinoma of the breast. Br J Cancer 1987;55:553—9.
    27. Sigurdsson H., Baldetorp B., Borg A. et al. Indicators of prognosis in nodenegative breast cancer. N Engl J Med 1990;322:1045-53.