Фактор роста эндотелия сосудов, его рецепторы и антиапоптотические белки Фактор роста эндотелия сосудов, его рецепторы и антиапоптотические белки BCL-2 и акт при раке молочной железы - Вместе против рака
    Главная / Литература / Статьи для специалистов / Рак молочной железы / Фактор роста эндотелия сосудов, его рецепторы и антиапоптотические белки Фактор роста эндотелия сосудов, его рецепторы и антиапоптотические белки BCL-2 и акт при раке молочной железы

    Фактор роста эндотелия сосудов, его рецепторы и антиапоптотические белки Фактор роста эндотелия сосудов, его рецепторы и антиапоптотические белки BCL-2 и акт при раке молочной железы

    Дата: 29.12.08

    The levels of vascular endothelial growth factor (VEGF), its receptors VEGFR-1 and VEGFR-2, and antiapoptotic proteins Bcl-2 and pAkt were studied in the tumors and homologous tissues of 46 patients with breast cancer. The levels of VEGF, its receptors, and Bcl-2 were significantly higher in 73-85% of the tumors as compared with adjacent histologically unchanged breast tissues, the elevated levels of pAkt, one of the VEGF effectors, being found in approximately half the tumors under study. Tumor capacity for enhanced VEGF production was detected just in early stages of the disease. There was a relationship of the components of the VEGF signaling pathway to the hormone dependence parameters: the levels of VEGF and VEGFR-2 increased in progesterone receptor (PR)-negati­ve tumors, the content of VEGFR-2 significantly correlating with that of PR (R= -038; p < 0.05). The levels of both pAkt and Bcl-2 significantly correlated with the status of estrogen receptors (ER); there was also a tendency for these parameters to increase in ER-positive tumors. On other hand, the rate of tumor pAkt elevation significantly increased in PR-negative tumors.

    Важную роль в регуляции опухолевой про­грессии играют факторы роста, стимулирующие развитие новых сосудов в опухоли — неоангиогенез [1, 2]. За последние 15 лет стало известно, что ключевым регулятором неоангиогенеза является фактор роста эндотелия сосудов (VEGF/VEGF-А/VPF) [1, 2], белок, индуцирующий активный рост клеток эндотелия и формирование новых ка­пилляров. Ряд фактов указывает на то, что VEGF не только обладает проангиогенной активностью, но и может непосредственно участвовать в регуля­ции пролиферации клеток опухоли. Об этом сви­детельствуют, в частности, результаты работ, про­демонстрировавших участие VEGF в регуляции выживаемости и пролиферации некоторых куль­тивируемых in vitro опухолевых клеток [3—5]. Биологический эффект VEGF опосредуется его рецепторами VEGFR-1/Flt-1 и VEGFR-2/Flk-1/KDR, типичными рецепторными тирозинкиназами (трансмембранные гликопротеиды с молеку­лярной массой 170—235 кДa) [2]. Известно, что VEGF принимает участие в регуляции значитель­ного числа внутриклеточных сигнальных путей, как митогенных, так и антиапоптотических, в ча­стности, нижележащими эффекторами VEGF яв­ляются белки, контролирующие апоптоз, — Akt (протеинкиназа В) и Bcl-2 [2, 5].

    В последние годы в литературе активно обсу­ждается вопрос о роли сигнальных путей VEGF при раке молочной железы (РМЖ). По данным ряда авторов, уровень VEGF и его нижележащих эффекторов (VEGFR-1, VEGFR-2, PI3-K, Akt, mTOR и др.) может иметь значение в прогнозе выживаемости и чувствительности к различным ви­дам терапии при РМЖ [1, 2, 6]. Кроме того, неко­торые компоненты сигнального пути VEGF рас­сматриваются в настоящее время как перспектив­ные мишени противоопухолевой терапии — осо­бенно активно исследуются возможности подав­ления роста опухоли с помощью антител к VEGF и специфических ингибиторов тирозинкиназ VEGFR-1 и VEGFR-2 [7]. В этой связи не теряют актуальности исследование содержания белков сигнального пути VEGF в опухолях и оценка воз­можной взаимосвязи этих параметров с основны­ми клинико-морфологическими характеристика­ми заболевания.

    Целью настоящего исследования было опре­деление уровня VEGF, его рецепторов VEGFR-1 и VEGFR-2, Bcl-2 и активированной формы антиапоптотического белка Akt (pAkt) в опухолях и окружающих неизмененных тканях больных РМЖ и оценка возможной взаимосвязи этих по­казателей с основными клинико-морфологиче­скими факторами.

    Материалы и методы

    В исследование было включено 46 больных РМЖ I—IV стадии, проходивших лечение в ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН в 2002-2004 гг. Возраст больных составил 35—75 лет (медиана 55 лет). Распределение обследованных больных по стадиям заболевания представлено в табл. 1. Образцы опухолевой и гистологически неиз­мененной ткани молочной железы (200—300 мг) бы­ли взяты во время операции и немедленно заморо­жены в жидком азоте для дальнейшего хранения при -70°С. Для проведения иммуноферментного анализа образцы тканей лизировали в соотношении 1:3 в буфере следующего состава: 20 мМ трис-НСl (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ЭГТА, 1% Тритон X-100, 2,5 мМ пирофосфат натрия, 1 мМ р-глицерофосфат, 1 мМ ортованадат натрия, 1 мкг/мл леупептина. Полученные лизаты центри­фугировали в течение 30 мин при 22 000 об/мин, 4°С (центрифуга OptimaTM TLX, Beckman, США).

    Таблица 1. Распределение обследованных больных по стадиям заболевания


    (Bio-Tek Instruments, Inc., США). Концентрацию показателей выражали в расчете на 1 мг общего белка, определенного по методу Лоури. Уровень активированной (фосфорилированной) формы белка Akt (далее pAkt) исследован в опухолях и ги­стологически неизмененных тканях молочной железы 46 больных, у 39 больных параллельно оценивали содержание VEGF, VEGFR-1, VEGFR-2 и у 38 больных определен уровень Bcl-2.

    Во всех опухолевых образцах конкурентным радиолигандным методом, как описано ранее [8], определено содержание рецепторов эстрогенов (РЭ) и рецепторов прогестерона (РП). Опухоли считали положительными по соответствующему виду рецепторов при их концентрации не менее 10 фмоль/мг белка.

    При сравнении показателей использовали t-критерий Стьюдента, критерий Манна — Уитни, медианный тест, критерий серий Вальда — Вольфовица, корреляционный тест Пирсона (r) и тест корреляции рангов Спирмена (R). Статистиче­скую обработку данных осуществляли с помощью программных пакетов «Statistica 6.0» (StatSoft Inc) и «Origin 6.0» (OriginLab Corporation).

    Таблица 2. Наборы реактивов для иммуноферментного анализа, используемые в работе



    Исследуемые показатели в лизатах оценива­ли с помощью стандартных наборов для прямого иммуноферментного анализа в соответствии с ин­струкциями производителей. Коммерческие на­звания и производители соответствующих набо­ров реактивов приведены в табл. 2.

    Показатели измеряли на автоматическом универсальном ридере для микропланшет ELX800

    Результаты

    В табл. 3 представлены результаты определе­ния VEGF и его рецепторов 1-го и 2-го типа в опухолевой и гистологически неизмененной тка­ни молочной железы. Обнаружено, что содержа­ние VEGF в опухолях молочной железы выше, чем в гистологически неизмененных тканях у 33 (85%) из 39 обследованных больных, при этом среднее значение и медиана этого показателя также достоверно возрастали в опухолевой ткани (p<0,01). Выявлено также достоверное уве­личение уровня VEGFR-1 (p<0,05) и VEGFR-2 (p< 0,01) в опухолевой ткани. Содержание VEGFR-1 в лизатах РМЖ было повышено у 28 (72%) из 39 обследованных больных на 4—161% по сравнению с окружающей неизмененной мо­лочной железой. Сравнивая уровни VEGFR-2 в опухолевой и нормальной тканях, мы обнаружи­ли увеличение его содержания в опухоли на 3-426% у 82% больных.

    Таблица 3. Содержание VEGF, VEGFR-1 и VEGFR-2 в опухолевой и гистологически неиз­мененной ткани молочной железы (M ± m; медиана [25—75% квартили])


    Таблица 4. Содержание VEGF, VEGFR-1, VEGFR-2, pAkt и Bcl-2 в ткани РМЖ в зависимо­сти от клинической стадии и степени распространенности процесса (медиа­на; 25—75% квартили)


    Отмечена слабая, но достоверная прямая корреляция между уровнями VEGFR-1 и VEGF в опухолевой ткани (r=0,33; p<0,05). Уровни VEGFR-2 и VEGF в опухоли также коррелировали между собой (r=0,47; p<0,05; рис.1), однако взаимосвязи между содержани­ем двух типов рецепторов в опухолевой ткани не наблюдалось.
    У 22 (48%) из 46 обследованных больных уро­вень pAkt, одного из нижележащих эффекторов VEGF, в опухоли был выше, чем в гомологичной гистологически неизмененной ткани. Попарное сравнение уровня pAkt в опухолевой и гистологи­чески неизмененной ткани для каждого больного представлено на рис.2: содержание pAkt как в опу­холи, так и в неизмененных тканях молочной же­лезы значительно варьировало; при этом уровни pAkt в опухолевой и неизмененной ткани молоч­ной железы достоверно положительно коррелиро­вали между собой (r=0,5; p<0,05).

    Определение уровня другого нижележащего эффектора VEGF, антиапоптотического белка Bcl-2, выявило достоверное отличие медианных значений этого показателя в опухоли и неизме­ненной ткани, при этом медиана уровня Bcl-2 бы­ла в 3,5 раза выше в опухолевой по сравнению с гомологичной тканью молочной железы (рис. 3).

    Таблица 5. Содержание VEGF, VEGFR-в зависимости от статуса 25—75% квартили) 1, VEGFR-2, рецепторов pAkt и Bcl-2 в ткани стероидных гормонов РМЖ (медиана; 25-75% квартили)


    Рис. 1. Взаимосвязь содержания VEGF и VEGFR-2 в опухолевой ткани молочной железы (r=0,47; p<0,05)

    Рис. 2. Уровень рАkt в опухолях и гистологически неизме­ненных тканях молочной железы (попарное сравнение показателей для каждого больного)



    Рис. 3. Уровень Bcl-2 в опухолях и гистологически неизме­ненных тканях молочной железы. * p < 0,0001


    У 31 (82%) из 38 больных содержание Bcl-2 в опу­холи было выше, чем в гомологичной гистологи­чески неизмененной ткани молочной железы.

    Дальнейший анализ включал оценку содер­жания VEGF, VEGFR-1, VEGFR-2, pAkt и Bcl-2 в ткани РМЖ в зависимости от основных клинико-морфологических характеристик заболевания. Уровень всех исследованных показателей не зави­сел от возраста, менопаузного статуса больных, степени дифференцировки и гистологического типа опухоли. Известно, что клиническая стадия является наиболее значимым прогностическим фактором при РМЖ. Результаты определения содержания VEGF, VEGFR-1, VEGFR-2, pAkt и Bcl-2 в ткани РМЖ в зависимости от клинической стадии и сте­пени распространенности процесса представлены в табл. 4.

    Как следует из этой таблицы, уровень VEGF достоверно возрастает на ранних стадиях заболе­вания, в опухолях небольших размеров и у боль­ных без поражения лимфатических узлов. Показано также, что содержание VEGFR-1 в опухоли имеет тенденцию к увеличению на ранних стади­ях РМЖ и достоверно возрастает у больных без поражения лимфатических узлов. Напротив, уро­вень pAkt в опухолях больных РМЖ I—Па стадии ниже, чем при более поздних клинических стади­ях; при этом статистически значимы различия со­держания pAkt в опухоли только между группами больных РМЖ I-IIa и IIb стадии (p<0,05; медиан­ное значение уровня pAkt в 1,6 раза больше при ПЬ стадии, чем при I—Па стадии). Взаимосвязи уровней VEGFR-2 с клинической стадией РМЖ и степенью распространенности процесса не выяв­лено. У больных РМЖ ШЬ стадии обнаружена тенденция к значительному повышению уровня Bcl-2 в опухоли: в этой группе уровень Bcl-2 воз­растал в 9 и более раз по сравнению с ранними клиническими стадиями, однако статистической значимости эти различия не достигали.

    Рис. 4. Содержание pAkt в опухолевой ткани молочной железы в зависимости от рецепторного статуса. * p < 0,01


    Наибольший интерес с нашей точки зрения представляло исследование соотношения уровня VEGF, VEGFR-1, VEGFR-2, pAkt и Bcl-2 с показателями гормонозависимости опухоли, а именно с содержанием рецепторов стероидных гормонов (табл. 5). Наблюдается тенденция к увеличению уровня VEGF в группе РЭ-отрицательных опухо­лей по сравнению с РЭ-положительными образца­ми, однако достоверной взаимосвязи уровней VEGF, VEGFR-1 и VEGFR-2 со статусом рецепторов эстрогенов не обнаружено. Выявлена также тенденция к увеличению содержания VEGF в РП-отрицательных опухолях по сравнению с РП-положительными образцами. Кроме того, при РП-отрицательном статусе отмечено более значительное повышение уровня VEGF в опухоли по сравнению с неизмененной тканью (увеличение на 5—778 пг/мг, медиана 50 пг/мг), чем при РП-положительном (увеличение на 3—421 пг/мг, медиана 25 пг/мг); это различие относительного увеличения содержа­ния VEGF между РП - и РП+- группами достоверно (p<0,05). Уровень VEGFR-1 в опухоли не зависел от статуса РП, а содержание VEGFR-2 достоверно коррелировало с уровнем РП (R=-0,38; p<0,05), при этом уровень VEGFR-2 был достоверно увели­чен в РП-отрицательных опухолях по сравнению с РП-положительными (см. табл. 5).

    В опухолевой ткани молочной железы уро­вень pAkt слабо, но достоверно коррелировал cо статусом РЭ (r=0,23; p<0,05), при этом обнаруже­на тенденция к увеличению уровня pAkt в РЭ-положительных образцах по сравнению с РЭ-отрицательными опухолями, а также в РП-отрица­тельных опухолях по сравнению с РП-положи­тельными. Частота повышения уровня pAkt в опухоли (по сравнению с гистологически неизме­ненной тканью) достоверно выше (в 2 раза) у больных с РП-отрицательными опухолями по сравнению с РП-положительными (p<0,01). Вза­имосвязи частоты повышения pAkt в опухоли со статусом РЭ не выявлено (рис. 4).

    Наблюдается тенденция к повышению уровня Bcl-2 в РЭ-положительных опухолях по сравнению с РЭ-отрицательными образцами, а также в РП-положительных опухолях по сравне­нию с РП-отрицательными образцами, однако статистической значимости отличия не достига­ют (см. табл. 5). При этом уровень Bcl-2 в опухо­левой ткани слабо, но достоверно коррелировал со статусом РЭ (r=0,23; p<0,05).

    Заключение

    Таким образом, нам удалось продемонстри­ровать, что уровень VEGF, его рецепторов и антиапоптотического белка Bcl-2 достоверно выше в 73—85% опухолей по сравнению с окружающими гистологически неизмененными тканями молоч­ной железы, при этом увеличение уровня pAkt, одного из эффекторов VEGF, выявлено лишь в половине исследованных опухолей. Уже на ран­них стадиях заболевания обнаружена способность опухоли к повышенной продукции VEGF и, по-видимому, его рецептора 1-го типа, что, по мне­нию многих авторов, является показателем плохо­го прогноза заболевания и высокого риска обра­зования метастазов [2, 9].

    Напротив, тенденция к увеличению уровня как pAkt, так и Bcl-2 проявля­ется на более поздних клинических стадиях и вза­имосвязана со значительной распространенно­стью процесса. Продемонстрированная достовер­ная корреляция содержания VEGF в опухолевой ткани с уровнями VEGFR-1 и VEGFR-2 может указывать на возможную коэкспрессию некото­рых компонентов сигнального пути VEGF в клет­ках РМЖ и их аутокринную роль. В целом резуль­таты нашего исследования косвенно свидетельст­вуют о координированной активации VEGF-зависимых механизмов в опухоли. Обнаружена взаимосвязь компонентов сигнального пути VEGF с показателями гормо­нозависимости: уровни VEGF и VEGFR-2 были повышены в РП-отрицательных опухолях, на­блюдалась также тенденция к увеличению со­держания VEGF в РЭ-отрицательных образцах. Уровни как pAkt, так и Bcl-2 достоверно корре­лировали со статусом РЭ, при этом выявлена тенденция к увеличению этих показателей в РЭ-положительных опухолях. Напротив, тенденция к увеличению содержания pAkt проявлялась в РП-отрицательных опухолях, а частота повыше­ния pAkt в опухолях больных этой группы дос­товерно возрастала.

    По-видимому, утрата опу­холью гормональной зависимости может быть ассоциирована в некоторых случаях с повышен­ной продукцией ангиогенных факторов, их ре­цепторов, а также с изменениями в балансе ме­жду белками, регулирующими апоптоз и выжи­ваемость клеток. Данные, полученные в нашей работе, согласуются с последними наблюдения­ми L. Ryden и соавт. [6], продемонстрировавших обратную корреляцию между уровнями VEGFR-2 и РП у больных РМЖ. VEGF-статус рассматривается этими авторами в качестве маркера дифференциальной чувствительности РЭ-положительных опухолей молочной железы к тамоксифену: прогноз гормонотерапии для больных с VEGF-положительным статусом был наиболее неблагоприятный. Обнаруженное на­ми отсутствие взаимосвязи между показателями тканевой экспрессии двух типов рецепторов VEGF подтверждает высказанные ранее пред­положения о разной роли VEGFR-1 и VEGFR-2 в ангиогенезе и опухолевом росте [2, 10—12]. В то же время продемонстрированная нами на клиническом материале корреляция уровня pAkt со статусом РЭ и тенденция к повышению этого показателя в РЭ-положительных опухолях согласуется с данными экспериментальных работ о взаимной регуляции Akt и РЭ [13, 14]. По­вышенный уровень pAkt рассматривается в последнее время некоторыми авторами как фактор, определяющий неблагоприятный прогноз химио- и гормонотерапии РМЖ, а также свиде­тельствующий о резистентности к герцептину [15].

    Таким образом, компоненты сигнального пути VEGF являются достаточно перспектив­ными биомаркерами РМЖ не только в качестве показателей неоангиогенеза, но и в качестве возможных факторов неблагоприятного про­гноза гормонотерапии.

    Авторы: А.М. Щербаков, Е.С. Герштейн, О.А. Анурова, Н.Е. Кушлинский ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
    VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR, ITS RECEPTORS, AND ANTIAPOPTOTIC PROTEINS Bcl-2 AND pAkt IN BREAST CANCER
    A.M. Shcherbakov, Ye.S. Gershtein, O.A. Anurova, N.Ye. Kushlinsky N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow

    Материал взят из журнала "Маммология", №3, 2006


    ЛИТЕРАТУРА:

    1. Герштейн Е.С., Кушлинский Н.Е. Биологические маркеры рака молоч­ной железы: методологические аспекты и клинические рекомендации. Маммология 2005;(1): 65-9.
    2. Ferrara N. The role of VEGF in the regulation of physiological and pathological angiogenesis. EXS 2005; (94): 209-31.
    3. Bachelder R.E., Wendt M.A., Mercurio A.M. Vascular endothelial growth factor promotes breast carcinoma invasion in an autocrine manner by regulating the chemokine receptor CXCR4. Cancer Res 2002; 62 (24): 7203-6.
    4. Miralem T., Steinberg R., Price D., Avraham H. VEGF(165) requires extra­cellular matrix components to inducemitogenic effects and migratory response in breast cancer cells. Oncogene 2001 ;20 (39):5511-24.
    5. Price D.J., Miralem T., Jiang S. et al. Role of vascular endothelial growth fac­tor in the stimulation of cellular invasion and signaling of breast cancer cells. Cell Growth Differ 2001; 12 (3): 129-35.
    6. Ryden L., Stendahl M., Jonsson H. et al. Tumor-specific VEGF-A and VEGFR2 in postmenopausal breast can­cer patients with long-term follow-up. Implication of a link between VEGF pathway and tamoxifen response. Breast Cancer Res Treat 2005; 89 (2): 135-43. 7. Jain R.K., Duda D.G., Clark J.W., Loeffler J.S. Lessons from phase III cli­nical trials on anti-VEGF therapy for cancer. Natl Clin Pract Oncol 2006; 3 (1): 24-40.
    8.Кушлинский Н.Е., Герштейн Е.С. Биохимические критерии прогноза и гормоночувствительности рака молочной железы: сравнительный анализ клинического значения иссле­дования рецепторов стероидных гор­монов и рецепторов эпидермального фактора роста в опухолях. Маммология 1996;(3):15—25.
    9. Gasparini G. Prognostic value of vas­ cular endothelial growth factor in breast cancer. Oncologist 2000; 5(Suppl 1): 37-44.
    10. Жукова Л.Г., Жуков Н.В., Личиницер М.Р. Экспрессия рецепторов VEGF FLT-1 и FLK-1 на опухолевых клетках - новый фактор прогноза при местно-распространенном раке молочной железы. Бюлл экспер биол 2003;135 (5): 478-81.
    11. Cross M.J., Dixelius J., Matsumoto T., Claesson-Welsh L. VEGF-receptor signal transduction. Trends Biochem Sci 2003; 28 (9): 488-94.
    12. Prager G.W., Breuss J.M., Steurer S. et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF) induces rapid pro-urokinase (pro-uPA) activation on the surface of endothelial cells. Blood 2004; 103 (3): 955-62.
    13. Campbell R.A., Bhat-Nakshatri P., Patel N.M. et al. Phosphatidylinositol 3- kinase/AKT-mediated activation of estrogen receptor alpha: a new model for anti-estrogen resistance. J Biol Chem 2001;276 (13): 9817-24.
    14. Stoica G.E., Franke T.F., Wellstein A. et al. Estradiol rapidly activates Akt via the ErbB2 signaling pathway. Mol Endocrinol 2003; 17 (5): 818-30.
    15. Tokunaga E., Kimura Y., Oki E. et al. Akt is frequently activated in HER2/neu-positive breast cancers and associated with poor prognosis among hormone- treated patients. Int J Cancer 2006; 118 (2): 284-9.