Субпопуляции В-лимфоцитов у больных раком молочной железы: LEC - специфические В-клетки - Вместе против рака
    Главная / Литература / Статьи для специалистов / Рак молочной железы / Субпопуляции В-лимфоцитов у больных раком молочной железы: LEC - специфические В-клетки

    Субпопуляции В-лимфоцитов у больных раком молочной железы: LEC - специфические В-клетки

    Дата: 29.12.08

    The paper's evidence suggests the B lymphocytes are heterogenic in patients with breast cancer. They were similar to those from donors in most markers; only the proportion of CD23-positive B-cells was more significant in patients with breast cancer. Binding of the fluorescently labeled Gal?1-3GlcNAc disaccharide to B lymphocytes from patients with breast cancer and donors was observed. The membrane receptors of CD5-positive B lymphocytes have been first shown to be able to bind Gal?1-3GlcNAc disac­charide. This may be evidence for the involvement of this cell population in an antitumor immune response to cancer cells expressing the study carbohydrate determinant on the membrane. At present, the authors are now investigating Lec-specific antibodies in the serum from patients with breast cancer.

    В последние годы проявляется повышенный интерес к исследованию гуморального противоопу­холевого иммунитета у больных раком молочной железы (РМЖ) [1]. Это обусловлено рядом причин.

    Многие опухолеспецифические и опухолеассоциированные антигены клеток РМЖ по своей химической структуре относятся к углеводным де­терминантам в составе мембранных гликопротеинов (например, муцинов) [2]. Эти детерминанты являются иммуногенными (развивается гумораль­ный иммунный ответ), против многих из них полу­чены моноклональные антитела (МКА), которые эффективно используются в клинике при опреде­лении у больных уровней сывороточных карбогидратных (СА) маркеров, например, СА 15.3 [3]. Доказано, что гуморальный иммунный ответ на опухолевые антигены может развиваться непосред­ственно в ткани РМЖ (формирование фолликулов, выраженная плазмоклеточная реакция, секреция В-клетками и плазмоцитами антител), что наглядно продемонстрировано при медуллярном раке [4, 5]. Накапливается все больше данных относи­тельно роли так называемого естественного гумо­рального иммунитета, обусловленного полиреак­тивными пентамерными IgM, продуцируемыми CD5-положительными В-лимфоцитами, в проти­воопухолевой защите при РМЖ [2].

    Оценка на клеточном уровне специфических показателей гуморального иммунитета к углевод­ным детерминантам у больных РМЖ представляет достаточно сложную и методически во многом не решенную задачу. Это обусловлено тем, что относи­тельное содержание В-лимфоцитов в перифериче­ской крови больных РМЖ невелико (около 10%), и специфические клоны в пределах них представляют минорную фракцию. Кроме того, очень важна точ­ная идентификация углеводной детерминанты-ми­шени на клетках опухоли, по отношению к которой развивается гуморальный иммунный ответ.

    В 1994 г. работами P.D. Rye и соавт. [7] было установлено существование иммуногенной детер­минанты в составе 230 кД гликопротеина мембра­ны клеток РМЖ и получены МКА LU-BCRU-G7. Антиген отсутствовал в ткани нормальной молоч­ной железы, определялся в 57% случаев РМЖ и был ассоциирован с неблагоприятным прогнозом при ранних стадиях заболевания. Исследования, проведенные нами при ранних стадиях РМЖ (T1— 2N0M0) и длительном (более 8 лет) наблюде­нии за больными после операции, подтвердили прогностическое значение маркера [8]. По хими­ческой структуре антиген соответствовал дисахариду Gal|31-3GlcNAc (Lec) [9].

    В настоящей работе нами представлены ре­зультаты исследования субпопуляционного соста­ва В-лимфоцитов крови больных РМЖ, особое внимание уделено оценке способности В-лимфо­цитов специфически связывать флюоресцентно меченный дисахарид Lec.

    Показатели В-клеточного звена иммунитета были проанализированы у 21 первичной больной РМЖ (до лечения). Средний возраст больных составлял 56,8± 2,4 года (от 35 до 75 лет, медиана —56 лет). Характе­ристика больных по стадиям заболевания предста­влена в табл. 1. Инфильтрирующий протоковый рак диагностирован у 15 больных, дольковый — у 2, аденогенный рак — у 1 больной. Еще у 3 больных диагноз РМЖ верифицирован цитологически. Контрольная группа включала 9 женщин в возрасте от 27 до 49 лет (6 здоровых доноров, 3 па­циентки с фиброаденомой молочной железы). У всех пациенток были оценены уровни экс­прессии основных активационных антигенов в пределах В-клеток (CD 19+). Характеристика субпопуляций В-лимфоци­тов в пределах CD19+ В-клеток проводилась с по­мощью трехцветной проточной цитометрии.

    Таблица 1. Характеристика больных РМЖ по стадиям заболевания



    Общую популяцию лейкоцитов выделяли путем стандартного лизиса эритроцитов, мононуклеарную фракцию — путем центрифугирования в градиенте фиколл-верографин. Из 5 мл гепаринизированной периферической крови больных РМЖ выделяли фракцию мононуклеаров. Для этого кровь, разведенную в 2 раза забуференным физиологическим раствором с добавлением бычь­его сывороточного альбумина (ЗФР-БСА), насла­ивали на фиккол-верографин и центрифугирова­ли при 1000 g 40 мин при комнатной температуре. Мононуклеары собирали пастеровской пипеткой из интерфазы и дважды отмывали ЗФР-БСА.

    С выделенными клетками проводили пря­мую реакцию иммунофлюоресценции (РИФ) в 96-луночном планшете. Для этого в каждую из 12 лунок вносили взвесь клеток в количестве не ме­нее 100 000. Далее в каждую лунку добавляли кок­тейль антител в соответствии с панелью и акку­ратно ресуспензировали пипеткой. Каждое МКА брали в количестве 10 мкл на лунку, суммарный объем МКА в лунке — 30 мкл. Клетки инкубировали с антителами в течение 30 мин при 4°С. По окончании времени инкубации клетки дважды отмывали от несвязавшихся антител путем центрифугиро­вания в течение 5—7 мин при 1000 g. Затем клетки переносили в специальные пластиковые пробирки для счета на проточном цитометре. Реакцию оценивали на проточном 5-параметровом цитометре FACScan (BD, США). Сбор и анализ клеток осуществ­лялся в гейте CD19+ клеток, включающем только популяцию В-лимфоцитов. Субпопу­ляции В-лимфоцитов в пределах CD19+ В-клеток характериленных в табл. 2. Абсолютное число клеток в 1 мкл крови подсчитывали на основании числа лейкоцитов и про­центного соотношения лимфоцитов в гемограмме на день исследования.

    Таблица 2. Панель исследованных антигенов



    В большинстве случаев использованы следу­ющие комбинации МКА (табл. 3).

    Таблица 3. Комбинации использованных МКА

    На первом этапе анализа идентифицировали В-клетки и определяли их процентное содержание в пределах лейко­цитов CD45 + + , как показано на рис.

    1. Далее в пределах гейта В-лимфоцитов опреде­ляли экспрессию различных дифференцировочных антиге­нов на клетках.

    Таблица 4. Показатели периферической крови больных РМЖ


    Показатели крови и содер­жание В-клеток у больных РМЖ представлены в табл. 4, в конт­рольной группе эти параметры были в пределах нормы.

    В целом по группе В-клетки (CD 19+) характе­ризовались, как и следовало ожидать, мономорфной экспрессией CD 20, НLА DR, большинство В-клеток были IgМ+. Содержание В-лимфоцитов с различными изотипами иммуноглобулинов было следующим: IgM - 85,2±2,8% (49,2-99,4%), IgG -18,7±5,7% (1,2-96,7), IgA - 10,4±1,3% (1,9-22,4%).

    Таблица 5. Иммунофенотипическая характеристика В-лимфоцитов у больных РМЖ


    Рис. 1. Гейт для анализа субпопуляционного состава В-клеток. а — выделение гейта лейкоцитов на основании экспрессии CD45 (ось Х — экспрессия CD45 FITC, гейт R1, на цитограмме выделен красным цветом); б — гейт В-клеток (CD 19+ ) — R2, по оси абсцисс — экспрессия В-клеточно-го антигена CD 19 PE/Cy5; в — контрольный образец ок­рашивания IgG1-PE/Cy5




    Рис. 2. Пример яркой экспрессии Lec на В-лимфоцитах. CD19+ В- лимфоциты накоплены в гейте R2. Оценка экспрессии CD5 (PE, ось Y) и связывания Lec (FITC —ось Х). Около 50% Lec-связывающих В-лимфоцитов со­ставляют CD 5+ В-клетки (1,5% клеток Lec+ CD5+, Lec+ - 3 ,13%)


    В-клетки были поликлональны: IgK в сред­нем 62,6±2,3%, Ig^ - 36,3±2,1%.

    В 18 (90%) из 20 изученных образцов на В-клетках выявлялась экспрессия активационного антигена CD23 (от 32,8 до 94,5%) одно­временно с экспрессией антигенов главного комплекса гистосовместимости II типа (HLA DR; табл. 5).

    В 7 (36,8%) из 19 образцов на В-клетках (CD 19+, CD20+) выявлялась экспрессия антиге­на CD5 (от 22,1 до 48,3%); в 14 (73,6%) из 19 об­разцов В-клетки коэкспрессировали активационный антиген CD38 с разбросом от 25,4% до мономорфной экспрессии (98,3%).

    Экспрессия молекул CD71, CD10, CD95 бы­ла достаточно гетерогенной.

    Достоверных различий между сравниваемыми группами по большинству популяций не выявлено. Вместе с тем содержание CD23- и HLA DR-положительных клеток было выше у больных РМЖ. У всех пациенток нами проанализировано наличие специфических рецепторов к дисахариду Lec на мембране В-лимфоцитов на основании способности В-клеток связывать опухолеассоциированный дисахарид Gal|31-3GlcNAc (Lec) в со­ставе флюорохромного зонда Lec-PAA-flu (в даль­нейшем обозначаемым просто Lec). В качестве контроля к Lec использовали меченный флюоро-хромом лактозамин дисахарид, схожий по струк­туре с Lec (Gal|31-4GlcNAc). Флюоресцентно ме­ченные пробы были любезно предоставлены про­фессором Н.В. Бовиным (ИБХ, Москва). У 85% (18 из 21) больных РМЖ и у 75% (6 из 8) доноров выявлялись В-клетки, связывающие дисахарид Lec. Средние уровни Lec-связывающих В-клеток у больных РМЖ составляли 6,0% (0,73 - 32,0%, медиана - 2,5%), у доноров - 5,4% (1,5-16,0%), различия недостоверны (р = 0,31). В-клетки, свя­зывающие большие количества Lec и дающие яр­кий флюоресцентный сигнал при проточно-цитометрическом анализе, выявлены в 78% (14 из 18) позитивных образцов, полученных от больных РМЖ (0,6-3,9%; медиана - 0,9%).

    Пример связывания Lec с В-клетками, вклю­чая клетки с ярким флюоресцентным сигналом, представлен на рис. 2. Одним из направлений работы явилась оцен­ка связывания Lec с субпопуляцией CD5+ В-кле­ток. Именно эти клетки, как известно, во многом определяют антительный ответ на углеводные ан­тигены и продуцируют так называемые естествен­ные антитела класса IgM.

    Lec+ CD5+ В-клетки были оценены у 12 больных. Во всех случаях рецепторы к Lec+ были экспрессированы как на CD5 + , так и на CD5- В-лимфоцитах. CD5+ В-клетки состав­ляли в среднем 50% от В-клеток, высокоаф­финных к Lec+.

    Таким образом, полученные в работе дан­ные свидетельствуют о гетерогенности В-лим­фоцитов у больных РМЖ. По большинству мар­керов они были сходны с донорской группой, лишь доля CD23+ В-клеток была большей у больных РМЖ.

    Отмечено связывание флюоресцентно ме­ченного дисахарида Gal|31-3GlcNAc В-лимфоцитами больных РМЖ и В-лимфоцитами доно­ров. Впервые показано, что мембранные рецеп­торы CD5+ В-лимфоцитов способны связывать дисахарид Gal|31-3GlcNAc. Это может служить указанием на участие данной популяции клеток в противоопухолевом иммунном ответе на ра­ковые клетки, экспрессирующие изучаемую углеводную детерминанту на мембране.

    В настоящее время нами проводится изуче­ние специфических антител к Lec в сыворотке крови больных РМЖ.

    Авторы: Н.А. Гадецкая, Л.Ю. Гривцова, З.Г. Кадагидзе, В.П. Летягин, Н.Н.Тупицын ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН

    B-LYMPHOCYTIC SUBPOPULATIONS IN PATIENTS WITH BREAST CANCER: Lec - SPECIFIC B CELLS
    N.A. Gadetskaya, L. Yu. Grivtsova, Z.G. Kadagidze, V.P. Letyagin, N.N. Tupitsyn N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow

    Материал взят из журнала "Маммология", №2, 2006

    ЛИТЕРАТУРА:

    1. Scanlan M.J., Gout I., Gordon C.M. et al. Humoral immunity to human breast cancer: antigen definition and quantitative analysis of mRNA expres­sion. Cancer Immun 2001; 1:4—20.
    2. Ho S.B., Ют Y.S. Encyclopedia of cancer 1997;2:309-24.
    3. Hilgers J., von Mensdorff-Pouilly S., Verstraeten A.A. et al. Quantitation of polymorphic epithelial mucin: a chal­lenge for biochemists and immunologists. Scand J Clin Lab Invest Suppl 1995; 221:81-6.
    4. Coronella J.A., Spier C., Welch M. et al. Antigen-driven oligoclonal expansion of tumor-infiltrating B cells in infiltrating ductal carcinoma of the breast. J Immunol 2002;169:1829-36.
    5. Hansen M.H., Nielsen H., Ditzel H.J. The tumor-infiltrating B cell response in medullary breast cancer is oligoclonal and directed against the autoantigen actin exposed on the surface of apoptotic cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA 2001;98(22):12659-664.
    6. Brandlein S., Pohle T., Ruoff N. et al. Natural IgM antibodies and immunosur-veillance mechanisms against epithelial cancer cells in humans. Cancer Res 2003;63:7995-8005.
    7. Rye P.D., Walker R.A. Prognostic value of a breast cancer-associated glycoprotein detected by monoclonal antibody LU-BCRU-G7. Eur J Cancer 1994;30(A):1007-12.
    8. Шинкарев С.А. Прогностическая роль маркера LU-BCRU-G7 при ран­них стадиях рака молочной железы рТ1-2N0M0. Автореф. дис... канд. мед. наук. М., 2004.
    9. Rye P.D., Bovin N.V., Vlasova E.V. et al. Breast cancer-associated antibody LU BCRU G7 recognises the terminal disaccharide Gal beta 1-3GlcNAc and can be used to isolate tumour cells from body fluids by an immunomagnetic bead pro­cedure. Biochem Soc Trans 1995;23(4):584S.