Биологические маркеры рака молочной железы: методологические аспекты и клинические рекомендации

Биологические (тканевые, клеточные, молекулярные) маркеры определяются непо­средственно в опухолевой ткани и характеризуют индивидуальные особенности опухоли, специ­фику ее «поведения» и регуляции. Количество показателей, рассматривающихся в качестве по­тенциальных биомаркеров, увеличивается лави­нообразно, что отражает быстрый прогресс в об­ласти изучения механизмов регуляции пролифе­рации и дифференцировки опухолевых клеток.

При раке молочной железы (РМЖ) определение любого молекулярного маркера в принципе мо­жет преследовать две практические задачи:

1. вы­явление группы риска, требующей дополнитель­ного лечения или более тщательного наблюде­ния, среди больных с ранними стадиями, не под­лежащих адъювантной терапии по клиническим и другим лабораторным показаниям;
2. оценка чувствительности к определенным видам тера­пии и(или) индивидуализация схем адъювантного лечения больных с распространенным процес­сом.

Еще одним аспектом практического исполь­зования результатов изучения молекулярно-биологических характеристик РМЖ может быть раз­работка новых препаратов, направленно воздей­ствующих на исследуемые белки (или гены) и блокирующих регулируемые ими процессы.В связи с тем, что, как уже отмечалось, ко­личество потенциально значимых биомаркеров очень велико, необходимы четкие критерии, по­зволяющие рекомендовать каждый конкретный показатель для практического применения. Основные условия включения маркера в схему обследования больного и использования резуль­татов его определения для выбора лечения сле­дующие:

1. его включение должно приводить к более благоприятным результатам лечения — увеличению безрецидивной или общей выжива­емости, улучшению качества жизни и(или) сни­жению стоимости;
2. эти преимущества должны иметь I уровень доказательности (АSСО) — до­казательства получены либо в специальном мас­штабном рандомизированном проспективном исследовании, либо в результате мета-анализа значительного числа относительно небольших исследований;
3. необходимы стандартизован­ные воспроизводимые методы с четко обозна­ченными критериями, а также наличие внутренних и внешних программ контроля качества.

В связи с этим количество биомаркеров, реально используемых и рекомендуемых международны­ми организациями для обследования больных РМЖ, весьма ограничено.

Рецепторы стероидных, гормонов — крите­рий чувствительности к эндокринной терапии

Одним из первых вошедших в практику лечения больных РМЖ показателей, относящихся к ка­тегории биологических маркеров, были рецеп­торы стероидных гормонов — белки, специфи­чески и избирательно связывающие соответст­вующие стероиды после их проникновения в клетку и опосредующие, таким образом, их био­логические эффекты. Сначала обратили внима­ние на рецепторы эстрогенов (РЭ), несколько позднее стали определять также рецепторы про­гестерона (РП). Присутствие РЭ в первичной опухоли молочной железы свидетельствует о ее потенциальной чувствительности к лечебным мероприятиям, направленным на удаление ис­точника эстрогенов из организма или на проти­водействие их эффектам. РП представляет инте­рес как молекулярный маркер РМЖ не только потому, что он является первым необходимым звеном реакции клетки на прогестины и опреде­ляет ее чувствительность к соответствующим препаратам, но и потому, что его синтез в клет­ках РМЖ индуцируется эстрогенами.

Таким об­разом, наличие РП может свидетельствовать о том, что РЭ, по крайней мере частично, функци­онально активны. Адъювантная эндокринная терапия наиболее эффективна у больных РМЖ с положительным рецепторным статусом: ее эф­фективность составляет около 10% при РЭ-отрицательных опухолях, примерно 50% — при РЭ-положительных опухолях и около 75% — при опухолях, содержащих одновременно РЭ и РП.

Известно также, что опухоли молочной же­лезы, содержащие оба или хотя бы один из ре­цепторов стероидных гормонов, имеют более благоприятное течение и послеоперационный прогноз у больных с такими опухолями, незави­симо от проводимого адъювантного лечения, лучше, чем у больных с рецепторотрицательными опухолями. Однако различия в выживаемо­сти не очень велики, поэтому наиболее важной в практическом отношении областью использова ния результатов определения РЭ и РП является отбор больных, чувствительных к эндокринной терапии. Практическое значение определения РЭ и РП для назначения эндокринной терапии подтверждено мета-анализом,-включавшим 37 тыс. больных операбельным РМЖ, участвовав­ших в 55 рандомизированных исследованиях.

В настоящее время в различных клиниках и лабораториях используется 3 относительно рав­нозначных метода определения рецепторного статуса РМЖ:

• радиолигандный — оценка связы­вающей способности рецепторов в цитозолях опухолей,
• иммуноферментный — определение концентрации иммунореактивного рецепторно­го белка в тех же цитозолях
• иммуногистохимический — специфическое окрашивание срезов опухоли с помощью антител к рецепторным бел­кам.

Преимуществом первых 2 методов является их количественный характер, позволяющий объ­ективизировать критерии оценки рецепторного статуса. Радиолигандный метод позволяет также оценить и функциональную активность рецепто­ра на одной из первых стадий его взаимодействия с гормоном, что делает прогноз гормоночувстви-тельности более надежным, чем при определе­нии иммунореактивных белков. С другой стороны, иммуногистохимический метод, хотя и носит относительно субъективный полуколи­чественный характер, имеет важное достоинство, заключающееся в том, что при окрашивании сре­зов можно четко определить принадлежность рецепторов именно опухолевым клеткам, что практически невозможно при использовании биохимических методов. Кроме того, этот метод позволяет работать с архивным материалом — парафиновыми блоками и даже готовыми стек­лами, что делает его единственно возможным вариантом в случаях, когда необходимость ис­следования рецепторов стероидных гормонов возникла или была осознана спустя длительное время после операции. Совпадение результатов определения рецепторного статуса РМЖ всеми 3 методами составляет в среднем 80—85%.

Факторы роста и их рецепторы — показа­тель способности опухоли к саморегулируемому ро­сту

Поскольку резистентность к эндокринной терапии может наблюдаться с самого начала даже у РЭ- и РП-положительных опухолей или разви­ваться позднее по мере прогрессирования болез­ни, рецепторный статус оказался необходимым, но не всегда достаточным показателем гормоно-чувствительности РМЖ. В связи с этим постоянно ведется поиск дополнительных критериев, хара­ктеризующих их функциональную активность и влияние других регуляторных факторов на био­логическое поведение РМЖ.

К числу важнейших регуляторов подобного типа относятся полипептидные факторы, продуцируемые опухолевыми клетками и другими компонентами опухолевой ткани (фибробластами, инфильтрирующими опухоль макрофагами и лимфоцитами, эндоте-лиоцитами) и стимулирующие рост клеток-про­дуцентов (аутокринный механизм) или соседних клеток (паракринный механизм). Многими исследователями, в том числе и в нашей лаборатории, было показано, что на­личие в опухоли молочной железы рецепторов эпидермального фактора роста (РЭФР), особен­но при отсутствии рецепторов стероидных гор­монов, свидетельствует о неблагоприятном про­гнозе заболевания даже на ранних стадиях и о резистентности к эндокринной терапии. Тем не менее из-за неоднозначности результа­тов, полученных разными авторами, ни один из показателей, характеризующих чувствитель­ность РМЖ к ауто/паракринным регуляторам, не вошел пока в рутинную клиническую практи­ку. Можно ожидать, однако, что в ближайшее время интерес к исследованию РЭФР при РМЖ вновь возрастет в связи с тем, что на стадию кли­нических испытаний вышли препараты, специ­фически воздействующие на РЭФР, — моно-клональные антитела к рецептору (цетуксимаб) и ингибиторы внутренней тирозинкиназы РЭФР, реализующей первый этап передачи митогенного сигнала (например, пресса).

Следует отметить, что до последнего време­ни «золотым стандартом» при исследовании РЭФР считалось радиолигандное определение в мембранной фракции тканей с использовани­ем 1251, меченного ЭФР, и разделением на гидроксилапатите, однако все большее значение приобретает и иммуногистохимический метод, прежде всего вследствие его удобства и большей безопасности.

НЕR2/neu — мишень для специфической тера­пии

Определенный прорыв в области практиче­ского использования маркеров, связанных с РЭФР-зависимой регуляцией роста РМЖ, про­изошел после появления герцептина, представля­ющего собой гуманизированные антитела к НЕR2/neu — одному из тирозинкиназных ре­цепторов семейства еrbB, к которому принадле­жит и РЭФР. Это одна из важнейших систем передачи митогенного сигнала в клетке.

Помимо структуры, рецепторы семейства еrbB различают­ся по относительной специфичности и сродству к различным общим лигандам (активирующим факторам). Основной особенностью всех рецеп-торных тирозинкиназ являются трансмембран­ная локализация и необходимость во взаимодей­ствии с соответствующим лигандом для реализа­ции киназной активности и последующих биоло­гических эффектов. После активации в результа те связывания лигандов и димеризации внутрен­няя тирозинкиназа рецепторов активируется и приобретает способность фосфорилировать как сам рецептор, так и другие клеточные белки. Ре­цепторы семейства ЕrbB могут образовывать как гомо-, так и гетеродимеры, при этом во многих случаях наиболее активными являются гетерост-руктуры с участием рецептора НЕR2/neu — уни­кального представителя рассматриваемого семейства, который, не имея собственного лиган-да и не взаимодействуя ни с одним из известных факторов роста, активирующих родственные рецепторы, является тем не менее ключевым зве­ном передачи митогенных сигналов всех ЭФР-подобных пептидов и необходим для успешного функционирования всей системы.

Блокирование НЕR2/neu может сущест­венно замедлить или остановить рост опухолей, зависимых от подобных стимулов, однако эффективное использование биологически активных препаратов предусматривает предва­рительную оценку индивидуальной чувстви­тельности больных к данному виду лечения.

При применении герцептина общепринятым и наиболее адекватным методом оценки чувст­вительности является использование иммуно-гистохимического (ИГХ) окрашивания опухо­левых тканей на белок НЕR2/neu с последую­щей оценкой амплификации гена c-erbBВ-2 ме­тодом флюоресцентной гибридизации in situ (FISH). Как правило, менее дорогостоящее ИГХ-исследование проводится в качестве пред­варительного общего скрининга, а FISH ис­пользуется в спорных случаях, когда ИГХ-метод не дает четко положительного или четко отри­цательного ответа. Подобный подход хорошо зарекомендовал себя в лечении больных РМЖ, позволяя обеспечить максимальную эффектив­ность лечения герцептином, избежав при этом неоправданных затрат на обследование. Что касается прогностического значения гиперэкспрессии или амплификации гена с-еrbB-2, то, несмотря на гигантский материал (к настоящему времени в разных лабораториях ми­ра обследовано более 12 тыс больных РМЖ), единого мнения о прогностической ценности НЕR2/neu пока нет. Некоторые авторы отмечают его неблагоприятное влияние на безрецидивную выживаемость больных с ранними стадиями РМЖ, другие не находят достоверной взаимосвя­зи этих показателей. Есть данные о том, что опухоли с амплифицированным геном НЕR2/пеи слабо реагируют на эндокринную те­рапию, но чувствительны к последующей химио­терапии. Считается также, что больным с НЕR2/neu-положительными опухолями следует рекомендовать более интенсивные режимы химиотерапии, чем больным с опухолями, не име­ющими повышенной экспрессии этого онкогена.

Наличие у НЕR-2/neu как внутриклеточ­ной, так и экстрацеллюлярной части приводит к тому, что в процессе димеризации возможны деградация молекулы рецептора и миграция его внешнего домена в межклеточную среду. Эта особенность и легла в основу разработки иммуноферментных систем для определения раство­римого НЕR-2/neu в сыворотке или в плазме крови. Уже опубликованы результаты, свиде­тельствующие о перспективности этого направ­ления, в первую очередь, для мониторинга эффективности лечения герцептином, тем не менее признается необходимость дальнейшего набора материала и выработки четких количест­венных критериев.

Система активации плазминогена — показа­тель метастатического потенциала РМЖ

Одно из фундаментальных свойств злокачественных опухолей — способность к метастазированию и инвазии. Важнейшим биохимическим меха­низмом этих процессов является разрушение ок­ружающей базальной мембраны и внеклеточно­го матрикса ассоциированными с опухолью протеазами, центральное место в котором занимает протеолитический каскад активации плазмино­гена в опухолевой ткани. В многоступен­чатой цепочке протеаз, ведущей к разрушению внеклеточного матрикса, ключевую позицию за­нимает активатор плазминогена урокиназного типа (uРА). Важную роль играет также находя­щийся на поверхности клеток рецептор uPА, по­скольку при связывании с ним способность uРА активировать плазминоген увеличивается. В це­лом процесс образования плазмина представля­ет собой циклическую амплификацию, регули­руемую по механизму обратной связи. Помимо uРА, в нем участвует также активатор тканевого типа (tРА), однако его роль при развитии опухо­лей, по-видимому, противоположна и сводится к разрушению опухолевых клеток и защите ок­ружающих тканей. Активность uPA и tPA подав­ляется 2 белковыми ингибиторами, принадлежа­щими к семейству серпинов, — РАI-1 и РАI-2.

Считается, что при опухолевом росте они также играют разную роль: РАI-1 защищает опухоле­вые клетки от саморазрушения, а РАI-2 тормо­зит протеолитические процессы во внеклеточ­ном матриксе. Различные компоненты системы активации плазминогена в ткани РМЖ могут находиться как на самих опухолевых клетках, так и на фибробластах стромы, инфильтрирую­щих опухоль лимфоцитах и макрофагах, эндоте-лиальных клетках, поэтому можно считать, что процесс активации плазминогена носит преиму­щественно паракринный характер. Уровень и соотношение экспрессии компо­нентов системы активации плазминогена в опу­холевой ткани могут служить показателем мета­статической и инвазивной активности опухоли, являясь вследствие этого биологически значи­мым фактором прогноза при злокачественных опухолях или показателем риска малигнизации доброкачественных новообразований. В доста­точно репрезентативных и многочисленных ис­следованиях продемонстрирована высокая про­гностическая значимость uРА и РАI-1 при РМЖ: риск рецидивирования или метастазирования даже при ранних стадиях заболевания возрастает в 1,5—3 раза, если уровень этих белков превыша­ет определенные пороговые значения.

Много­факторный анализ свидетельствует о том, что они являются независимыми факторами про­гноза. В связи с этим определение uРА или РАI-1 может быть рекомендовано у больных с ранни­ми стадиями РМЖ для выделения подгрупп с повышенным риском рецидивирования и(или) метастазирования, требующих более интенсив­ного лечения. Наиболее адекватным методом оценки уровня экспрессии компонентов системы акти­вации плазминогена в настоящее время считает­ся количественное иммуноферментное опреде­ление концентрации этих белков в цитозолях тканей. К сожалению, единые пороговые значения пока не установлены, хотя уже прово­дятся международные кооперированные иссле­дования в этом направлении.

Фактор роста эндотелия сосудов — показа­тель активности неоангиогенеза

В последние го­ды большое внимание уделяется проблеме не­оангиогенеза (формирования новых сосудов) в злокачественных опухолях. Уже не вызывает сомнения тот факт, что опухоль не может разви­ваться и расти без образования в ней разветвлен­ной сети капилляров, обеспечивающих снабже­ние клеток кислородом и питательными вещест­вами. Изучение молекулярных механизмов ан-гиогенеза позволило перейти от микроскопиче­ской оценки плотности сосудов в опухолевой ткани к исследованию конкретных молекул, участвующих в регуляции образования и роста новых сосудов. Важнейшим положительным ре­гулятором ангиогенеза бесспорно является фак­тор роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor - VEGF). Доказано, в частно­сти, что VEGF играет ключевую роль в неоангиогенезе при РМЖ. Результаты ряда ретроспективных клиниче­ских исследований свидетельствуют о том, что экспрессия VEGF при РМЖ имеет существен­ное значение для прогноза заболевания, а также влияет на чувствительность опухолей к гормональному и лекарственному лечению. Его высо­кий уровень свидетельствует о неблагоприятном прогнозе как при раннем, так и при распростра­ненном РМЖ. Кроме того, в настоящее время активно создаются и исследуются новые препа­раты с антиангиогенными свойствами, и оценка активности VEGF-зависимого ангиогенеза мо­жет стать основой для их целенаправленного применения. Попытки использовать показатели содер­жания VEGF в крови (как в сыворотке, так и в плазме) в качестве адекватной замены тканевой экспрессии этого белка при оценке активности ангиогенеза в РМЖ и прогнозировании исхода заболевания и(или) эффективности терапии до настоящего времени большого успеха не имели.

Таким образом, благодаря успехам биохи­мии, молекулярной биологии и биотехнологии в настоящее время в арсенале исследователей и клиницистов имеется огромное количество биологически значимых показателей, которые могут помочь в прогнозе раннего РМЖ и выборе адъювантной терапии при распространенном процессе. Тем не менее большинство молекуляр­ных маркеров пока еще прочно не вошли в ру­тинную практику, что определяется высокой стоимостью подобных исследований и сложно­стью интерпретации данных одновременного анализа многих прогностических факторов.

Для клинического использования международными организациями в настоящее время рекомендова­но лишь несколько из них, эффективность и по­лезность которых имеют достаточно высокий уровень доказательности, а именно:

1. определе­ние РЭ и РП у всех первичных больных для ре­шения вопроса о целесообразности назначения эндокринной терапии;
2. оценка экспрессии (амплификации гена) НЕR2/neu у больных рас­пространенным раком, если планируется лече­ние герцептином;
3. рассматривается также воз­можность определения опухолевой концентра­ции РАI-1 и/или uРА для выявления группы с повышенным риском рецидивирования и ме­тастазирования среди больных с ранними стади­ями процесса.

С появлением новых высокопроизводи­тельных технологий, позволяющих одновре­менно в очень небольшом образце определять несколько десятков или даже тысяч показате­лей, особенно актуальными становятся выбор оптимального набора информативных тестов, который позволил бы при минимальной стои­мости обследования обеспечить максималь­ную эффективность лечения каждого больно­го, а также разработка адекватного алгоритма интерпретации результатов этого комплексно­го анализа.

Авторы: Е.С. Герштейн, Н.Е. Кушлинский, ГУРОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН
Материал взят из журнала « Маммология», №1, 2005