Иммуноморфологическая диагностика микрометастазов рака молочной железы - пїЅпїЅпїЅпїЅпїЅпїЅ пїЅпїЅпїЅпїЅпїЅпїЅ пїЅпїЅпїЅпїЅ
    Главная / Литература / Статьи для специалистов / Рак молочной железы / Иммуноморфологическая диагностика микрометастазов рака молочной железы

    Иммуноморфологическая диагностика микрометастазов рака молочной железы

    Дата: 29.12.08

    Рак молочной железы (РМЖ) — одно из самых распространенных онкологических заболеваний у женщин. Согласно Б. Фишеру, РМЖ является системным заболеванием, и даже при клинически ранних стадиях (Т 1-2 N0М0) высока вероятность скрытой сиcтемной диссеминации опухолевого процесса.

    В связи с многочисленными трудностями в оценке прогноза и выборе адекватной тактики лечения злокачественных новообразований одной из актуальных проблем современной онкологии стали поиск новых методов диагностики и определения стадии опухолей, а также оценка противоопухолевого иммунитета.Обнаружение малых количеств метастатических клеток (микрометастазов) в костном мозге больных РМЖ служит показателем гематогенной диссеминации процесса и многими учеными расценивается как неблагоприятный признак, свидетельствующий о дальнейшем формировании метастазов, прежде всего в кости (Наrbесk N. и соавт., 1994; Вгаun S., Раntеl К., 2001).

    Для обнаружения единичных опухолевых клеток обычных диагностических методов недостаточно. Гистологический и цитологический методы исследования выявляют злокачественные клетки в костном мозге при их достаточно большом количестве, вследствие чего обнаружение метастазов становится возможным лишь на поздних стадиях РМЖ. При гистологическом исследовании возможно выявление 1 опухолевой клетки среди 100 миелокариоцитов (Sloane J., Ormerod М., 1980; Берензон Д.Г. и соавт., 2000).

    Реальное представление о степени распространенности процесса дают результаты иммуноморфологического исследования. Используя иммуноцитологический метод с применением моноклональных антител (МКА) к антигенам, экспрессируемым клетками эпителиальных опухолей и нехарактерным для гемопоэтической ткани, можно обнаружить 1 опухолевую клетку среди 1 млн миелокариоцитов.На клетках РМЖ почти в 100% случаев экспрессированы эпителиальный мембранный антиген (ЕМА), цитокератины (СК), туморассоциированный гликопротеин (ТАG-12), антиген мембран жировых глобул женского молока (НМFG-1), панэпителиальный антиген (ЕGР-34), реже — раковоэмбриональный антиген (РЭА) и ряд других.

    Развитие иммуноцитологии привело к появлению МКА к данным антигенам и открыло новые диагностические возможности для выявления единичных опухолевых клеток в лимфатических узлах, костном мозге, периферической крови. Полученные МКА обладают разной чувствительностью и специфичностью. Известно, что муциноподобный раковый антиген (МСА) экспрессируется клетками гемопоэза, МКА к ЕМА перекрестно реагируют с лимфоидными клетками костного мозга (Delsol G. и соавт., 1984; Heyderman Е., Macartney J, 1985). По мнению W. Janni и соавт. (2000), современным стандартом для обнаружения микрометастазов РМЖ в костный мозг являются антитела к цитокератинам.МКА САМ 5.2 взаимодействуют с цитокератинами 7 и 8 (Соорег D. и соавт., 1985; Smedts F.., 1990), а МКА к панцитокератинам КL-1 распознают цитокератины 2, 6, 8, 10, 11, 18, 19 и в меньшей степени — 5, 14, 15.

    Таким образом, представлялось актуальным изучить степень диссеминации РМЖ на основании выявления микрометастазов в костный мозг, оценить эффективность различных методов диагностики метастатического поражения костного мозга, определить различия между макро- и микрометастазами, сопоставить результаты иммуноцитологического метода с другими показателями распространенности процесса, проанализировать изменения в системе кроветворения при метастатическом поражении костного мозга.

    Целью настоящей работы было определение степени гематогенной диссеминации РМЖ на основании обнаружения метастатического поражения костного мозга высокочувствительными иммуноцитологическими методами с применением МКА к эпителиальным антигенам.
    Материалом для исследования послужили данные клинического, морфологического и иммуноцитологического обследования 53 больных РМЖ (в I— IV стадии), находившихся на лечении в хирургическом отделении опухолей молочных желез РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН в 1999—2001 гг. В исследуемую группу вошли женщины в возрасте от 27 до 72 лет.Распространенность процесса оценивали в соответствии с Международной классификацией злокачественных опухолей по системе ТNМ, а также клинической классификацией по стадиям (Иллюстрированное руководство по ТNМ, Атлас классификации злокачественных опухолей, 1998).

    У большинства больных была IIIb стадия (28,3%), на 2-м месте по частоте были больные с IIа стадией (22,6%). IIb стадия установлена в 18,9% случаев, IV стадия — в 15,1%, I стадия — в 9,4%. Наименьшее число больных было в IIIа стадии (5,7%).В репродуктивном возрасте находились 23 (43,4%) пациентки, в состоянии перименопаузы — 8 (15,1%), в менопаузе - 22 (41,5%).Наиболее частым гистологическим вариантом был инфильтративный протоковый рак (39,6%). Отмечена достаточно высокая частота инфильтративного долькового рака (32,1 %). Остальные гистологические формы (смешанный, тубулярный, медуллярный, слизистый и папиллярный рак) встречались реже.
    При морфологическом исследовании у всех пациенток было дано детальное описание тканей, окружающих опухоль и регионарный лимфатический аппарат, определены инвазия опухолевых клеток в лимфатические сосуды, наличие круглоклеточной инфильтрации, очагов некроза в опухоли. Степень злокачественности опухоли оценена у 39 больных. В большинстве случаев (74,4%) обнаружена II степень злокачественности, реже — III степень (23,1%) и лишь в 2,5% случаев отмечена I степень злокачественности.

    Степень дифференцировки опухоли оценена у 51 больной при цитологическом исследовании пунктата. Высокодифференцированный рак установлен у 4 (7,8%) больных, умереннодифференцированный — у 31 (60,8%), низкодифференцированный — у 16 (31,4%).

    В зависимости от стадии заболевания больным проводились различные методы комплексного, комбинированного, хирургического лечения. Оперативное вмешательство выполнено 47 пациенткам: 37 (69,8%) — радикальная мастэктомия с сохранением обеих грудных мышц, 8 (15,1%) — радикальная резекция молочной железы, 2 (3,8%) — двусторонняя радикальная мастэктомия. У 6 (11,3%) пациенток хирургического лечения не было (5 женщин получили консервативную терапию, 1 отказалась от оперативного вмешательства).Неоадъювантная терапия проведена 14 (26,4%) больным, из них у 13 в предоперационном периоде применялась химиолучевая терапия, у 1 — только химиотерапия. Адъювантная терапия выполнена 43 (81,1%) больным. В послеоперационном периоде проводились химиотерапия (34%), гормонотерапия (11,3%), лучевая терапия (7,6%) и их сочетания.Клетки костного мозга получали при пункции, которая выполнялась всем 53 больным до начала лечения (хирургического, неоадъювантного, консервативного).

    Пункцию осуществляли в области грудины (стернальная пункция). В отдельных случаях проводили одномоментную пункцию грудины и гребня подвздошной кости.
    Исследование костного мозга выполняли как стандартным цитологическим методом, так и иммуноцитологическим: реакция иммунофлюоресценции с применением МКА к цитокератинам САМ 5.2 («Becton Dickinson», США) и КL-1 («Immunotech», Франция).Положительной считали реакцию при наличии 1 метастатической клетки среди 1 млн миелокариоцитов. При использовании МКА к цитокератинам метастатические клетки легко обнаруживаются среди миелокариоцитов по наличию яркого специфического цитоплазматического флюоресцентного свечения. Подсчет клеток миелограммы и их анализ выполнен в клинической лаборатории.

    Метастазы, выявляемые при цитологическом исследовании костного мозга, обозначались как макрометастазы. Термин «микрометастазы» использовался нами применительно к метастазам, определяемым иммуноцитологическим методом. Безусловно, это лишь одна из разновидностей микрометастазов в широком смысле этого слова. Изначально термином «микрометастазы» обозначали кластер опухолевых клеток диаметром менее 2 мм, однако при иммуноцитологическом исследовании с применением МКА удается определить отдельные, «оккультные» раковые клетки, а не только их кластеры.

    При стандартном цитологическом исследовании метастазы в костный мозг были обнаружены у 2 из 53 (3,77%) больных. У одной из них IV клиническая стадия была установлена до обнаружения метастатических клеток в костном мозге T4N2M1 — конгломерат лимфатических узлов в подмышечной области, метастазы в лимфатические узлы эпигастральной области, парааортальные лимфатические узлы, печень).

    У другой пациентки исходная стадия заболевания была расценена как Т2N0M0 (IIа), после цитологического обнаружения метастазов в костный мозг стадия изменена на IV.
    Использование МКА САМ 5.2 и КL-1 позволило во всех случаях подтвердить наличие цитологически выявленных метастазов в костном мозге и существенно повысить частоту их обнаружения при иммуноморфологическом исследовании. Так с применением иммуноцитологического метода диагностики метастазы в костный мозг были выявлены у 24 (45,3%) больных.Важно, что в нашем исследовании количество опухолевых клеток, определяемых иммуноцитологически, было очень низким: от 1 до 12 среди 1 млн миелокариоцитов. Лишь у 2 из 28 больных иммуноцитологически было обнаружено 20 опухолевых клеток и у 1 больной — 45 клеток в 1 млн миелокариоцитов. Возможность выявления единичных опухолевых клеток является главной причиной большей чувствительности иммуноцитологии (по сравнению с цитологическим исследованием) и ее основным преимуществом.Частота иммуноцитологического обнаружения микрометастазов в костный мозг возрастала от I к IV стадии РМЖ (от 40 до 62,5%).
    Связь между овариальноменструальной функцией и наличием микрометастазов РМЖ в костный мозг была достоверной (р=0,031). Среднее количество метастатических клеток в костном мозге больных репродуктивного возраста оказалось в 3 раза выше, чем у больных в менопаузе.

    Рис. 1. Комплекс метастатических клеток в костном мозге. Цитоцентрифужный препарат. Окраска МКА КL-1. Ув. 400

    Установлена взаимосвязь между присутствием в костном мозге опухолевых клеток и рецепторным статусом опухоли. При отсутствии в опухоли рецепторов эстрогенов (РЭ-) микрометастазы в костный мозг наблюдались в 62,1 % случаев, а при их наличии (РЭ+) - в 28,6% (р=0,039) (рис. 2).

    Рис. 2. Распределение больных РМЖ в зависимости от статуса рецепторов эстрогенов в опухоли и иммуноцитологического выявления микрометастазов в костный мозг: 1 — больные без метастазов в костный мозг, 2 — с метастазами (здесь и на рис. 3)

    Рис. 3. Распределение больных РМЖ в зависимости от статуса рецепторов прогестерона в опухоли и выявления микрометастазов в костный мозг

    Выявлена также достоверная связь (р=0,02) между отсутствием в опухоли рецепторов прогестерона (РП-) и метастазированием РМЖ в костный мозг — в 76,9% случаев, в то время как при РП+ они встречались в 3 раза реже: у 25% больных (рис. 3).

    При отсутствии в опухоли рецепторов и эстрогенов и прогестерона (РЭ-РП-) у 84,6% больных в костном мозге имелись микрометастазы РМЖ. Среднее количество злокачественных клеток в костном мозге больных с указанной опухолью было в 6,4 раза выше, чем у больных с опухолью РЭ+РП+ (соответственно 5,89+1,37 и 0,92±0,77; р<0,05). Таким образом, наличие в костном мозге метастатических клеток РМЖ взаимосвязано с негативным статусом опухоли по рецепторам эстрогенов и прогестерона.Нами проанализирована связь между присутствием в костном мозге опухолевых клеток и биологическими характеристиками первичной опухоли.
    Обнаружена статистически достоверная взаимосвязь между круглоклеточной инфильтрацией и микрометастазами (р=0,023). Под круглоклеточной инфильтрацией понимают инфильтрацию опухоли лимфоцитами, макрофагами, плазматическими клетками. При выраженной круглоклеточной инфильтрации опухоли (++ и +++) злокачественные клетки в костном мозге определены у 83,3% пациенток, а при умеренной и слабой — соответственно у 58,3 и 33,3%.

    Статистически достоверной связи между наличием микрометастазов РМЖ в костный мозг и обнаружением комплексов злокачественных клеток в лимфатических щелях молочной железы, некрозом опухоли, степенью ее злокачественности, степенью дифференцировки, размером опухолевого узла, маммографическими признаками распространенности опухоли, а также ее локализацией в молочной железе не выявлено.Отсутствовала связь между микрометастазированием РМЖ в костный мозг и наличием лимфогенных метастазов в регионарные лимфатические узлы (индексом N, наличием конгломератов, количеством пораженных метастазами лимфатических узлов, прорастанием капсулы лимфатического узла опухолью).

    Представлялось интересным оценить наличие корреляции между метастазами в костный мозг и статусом лимфатических узлов у больных РМЖ.
    В нашем исследовании метастазирование РМЖ в костный мозг и в регионарные лимфатические узлы не было взаимосвязано. При любом индексе N частота выявления микрометастазов составляла 52—53%. Обнаружение при гистологическом исследовании прорастания капсулы лимфатического узла опухолью, реактивной гиперплазии лимфоидных и гистиоцитарных элементов синусов, конгломерата метастазов не увеличивало частоту выявления микрометастазов в костном мозге. На наш взгляд, полученные результаты подтверждают гипотезу о том, что лимфогенный и гематогенный пути метастазирования являются независимыми и равноценными, а опухолевые клетки могут попадать в кровоток, минуя аксиллярные лимфатические узлы.

    Анализ результатов радиоизотопного исследования костей у больных РМЖ не выявил достоверной взаимосвязи между метастатическим поражением костей по данным сцинтиграфии и частотой обнаружения микрометастазов в костном мозге. Иммуноцитологическая детекция опухолевых клеток в костном мозге и рентгенологическое обнаружение метастазов в кости не были взаимосвязаны ни в одной из групп.
    Нами было изучено состояние кроветворения у больных с макрометастазами, микрометастазами и без опухолевого поражения костного мозга. У 2 пациенток с макрометастазами РМЖ в костный мозг, подтвержденными цитологическим и иммуноцитологическим методами, наблюдалась выраженная реакция системы кроветворения в виде гипоплазии костного мозга.

    Cодержание миелокариоцитов и мегакариоцитов в костном мозге обеих пациенток было понижено. У одной из них гранулоцитарный и эритроидный ростки были относительно сохранны, однако среди клеток красного ряда преобладали оксифильные формы (24%; норма — 0,8—5,6%). У другой пациентки эритроидный росток был представлен единичными клетками (4,9%; норма — 14,5—26,5%), резко увеличено отношение лейкоцитов и эритробластов (15,0; норма — 2,1—4,5), понижен индекс созревания нейтрофилов, повышено количество моноцитов и лимфоцитов.В группе больных с микрометастазами в 2 раза чаще отмечено снижение клеточности костного мозга (53,6%), чем у пациенток без метастатического поражения костного мозга (28%; р<0,05).
    Косвенными признаками присутствия опухолевых клеток в костном мозге можно считать скопления 3—5 плазматических клеток и обнаружение крупных клеток с гиперхромным ядром и множественными нуклеолами, отличающихся от нормальных клеток костного мозга.Скопления плазматических клеток не типичны для нормальной миелограммы. У 100% больных, в пунктатах которых регистрируются такие скопления, иммуноцитологически выявлены микрометастазы в костный мозг. Таким образом, обнаружена достоверная связь между наличием в костном мозге скоплений плазматических клеток и обнаружением микрометастазов (р=0,001).
    Содержание моноцитов и лимфоцитов в костном мозге при наличии микрометастазов повышено.

    Так, количество моноцитов повышалось в 4 раза чаще у больных с опухолевым поражением костного мозга, чем у пациенток без метастазов. Среднее их значение составило соответственно 2,3 и 1,7 (р<0,05). Содержание лимфоцитов в костном мозге у больных с микрометастазами было достоверно выше, чем при отсутствии его опухолевого поражения (соответственно 13,9±0,98 и 10,7+0,5; р<0,01). Не исключено, что увеличение этого показателя носило относительный характер. Можно предположить, что подобные изменения служат наиболее ранним проявлением реакции костного мозга на присутствие отдельных опухолевых клеток.В анализах периферической крови не выявлено статистически достоверных различий в содержании эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, гемоглобина, уровне гематокрита и других показателей крови у больных с микрометастазами РМЖ в костный мозг и у пациенток без метастатического его поражения.

    Представленные нами данные демонстрируют необходимость внедрения в клиническую практику иммуноморфологического исследования костного мозга, особенно на ранних стадиях заболевания, для уточнения степени распространенности опухолевого процесса. Применение иммуноцитологического метода с использованием МКА к цитокератинам САМ 5.2 и КL-1 дает преимущества в обнаружении единичных опухолевых клеток в костном мозге больных РМЖ, что может явиться одним из основополагающих критериев прогноза и служить показанием для назначения адъювантной химиотерапии.

    Авторы: О.В. Крохина, В.П. Летягин, Н.Н. Тупицын, В.Н. Блиндарь, А.Д. Зикиряходжаев, ГУРОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН

    Материал взят из журнала « Маммология», №1, 2005