Клиническое значение VEGFR-2 в опухолях и сыворотках крови больных раком молочной железы - пїЅпїЅпїЅпїЅпїЅпїЅ пїЅпїЅпїЅпїЅпїЅпїЅ пїЅпїЅпїЅпїЅ
    Главная / Литература / Статьи для специалистов / Рак молочной железы / Клиническое значение VEGFR-2 в опухолях и сыворотках крови больных раком молочной железы

    Клиническое значение VEGFR-2 в опухолях и сыворотках крови больных раком молочной железы

    Дата: 27.04.10

    Е. А. Ким1, А. М. Платова2, И. В. Высоцкая1, Е. С. Герштейн2, В. П. Летягин2,

    Н. Е. Кушлинский2, Е.Е.Миронова2

    1ММА им. И. М. Сеченова

    2НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН

    Резюме

    В работе представлен анализ изменений содержания ангиогенного фактора VEGFR-2 в цитозолях опухоли и сыворотках крови 30 больных раком молочной железы, определенного иммуноферментным методом, в процессе неоадъювантного лечения, а также оценена взаимосвязь этого показателя с основными клинико-морфологическими характеристиками заболевания. Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования VEGFR-2 в качестве одного из прогностических маркеров рака молочной железы. Динамика показателя не зависела от вида проводимого лечения, однако, определена взаимосвязь содержания VEGFR-2 в остаточной опухоли после предоперационной терапии с выраженностью лечебного патоморфоза.

    Ключевые слова: VEGFR-2, ангиогенез, неоадъювантная терапия, рак молочной железы.

    Патологический ангиогенез является неотъемлемой частью опухолевого процесса, так как обеспечивает растущую опухоль кислородом и питательными веществами [1, 8]. Основным регулятором ангиогенеза является фактор роста эндотелия сосудов VEGF, обладающий специфическим митогенным действием в отношении эндотелия сосудов [3, 6]. В большинстве научных публикаций, посвященных неоангиогенезу при РМЖ, определено неблагоприятное прогностическое значение гиперэкспрессии VEGF в опухоли [9, 10, 11, 16], а также как фактора, предсказывающего вероятную резистентность к традиционным видам лекарственного и лучевого лечения [7].

    Свои ангиогенные эффекты VEGF реализует через специфические тирозинкиназные рецепторы, расположенные на поверхности эндотелиальных клеток – VEGFR-1 (flt-1) и VEGFR-2 (flk-1/KDR) [2, 5, 14]. Установлено, что на эндотелиальных клетках преимущественно экспрессируется рецептор VEGFR-2 и, по-видимому, VEGF осуществляет свои биологические эффекты через связывание именно с этим рецептором [13, 15].

    По данным литературы исследований, посвященных оценке клинического значения рецепторов VEGF, экспрессия которых обнаруживается в опухолевой ткани, немного, а результатов о соотношении уровня растворимых VEGFR-1 и VEGFR-2 в сыворотке крови с клинико-морфологическими особенностями РМЖ практически не представлено. Однако перспективность изучения этого направления несомненна. Так, показано, что уровни VEGF, рецепторов VEGFR-1, VEGFR-2 и антиапоптотического белка Вс1-2 были достоверно выше в ткани РМЖ по сравнению с окружающими гистологически неизмененными тканями. При этом экспрессия VEGF и VEGFR-2 существенно увеличивалась в отрицательных по рецепторам прогестерона опухолях [4].

    В другой работе авторы выявили, что у пациентов с положительным рецепторным статусом и низкой экспрессией VEGFR-2 в опухоли, адъювантная гормонотерапия тамоксифеном достоверно увеличивала продолжительность безрецидивной выживаемости, и наоборот, лечение тамоксифеном не имело длительного эффекта у пременопаузальных больных с высоким уровнем VEGFR-2 в опухоли [12].

    Рецепторы VEGF (в частности, VEGFR-2) могут быть перспективной мишенью для современной таргетной терапии, что свидетельствует о необходимости дальнейшего изучения экспрессии этих факторов у больных РМЖ [1, 2].

    Цель нашего исследования – определить возможную взаимосвязь содержания VEGFR-2 в опухоли и в сыворотке крови больных РМЖ с основными клинико-морфологическими критериями заболевания, а также проанализировать изменения показателей VEGFR-2 на фоне неоадъювантной терапии.

    Материалы и методы

    В исследование включено 30 больных местнораспространенным РМЖ в возрасте от 23 до 69 лет (медиана - 49,5 лет), проходивших обследование и лечение в клиниках ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН в 2005-2006 гг. Менструальная функция была сохранена у 10 женщин (33,3%), 7 пациенток (23,3%) находились в состоянии перименопаузы и у 13 больных была постменопауза (43,3%). Распределение больных в зависимости от стадии заболевания (Классификация злокачественных опухолей по системе ТNM, Методические рекомендации 2002 года, 6-е издание) представлено на рис.1

    Инфильтративный протоковый рак (ПИР) выявлен в большинстве гистологических препаратов – 23 наблюдения (76,7%), в 3 образцах (10%) – инфильтративный дольковый рак (ДИР). Инфильтративный протоковый рак с преобладанием внутрипротокового компонента обнаружен у 3-х больных (10%) и у 1 пациентки выявлена смешанная форма рака молочной железы. Всем пациенткам проводилась неоадъювантная терапия: 10 больных получили 2 курса предоперационной полихимиотерапии по схеме FAC, во II группу вошло 10 больных, которым проводилась сочетанная химиолучевая терапия (химиотерапия по схеме FAC+лучевая терапия РОД 3Гр, СОД 28-40 изоГр), остальные 10 пациенток, составившие III группу, получили только лучевую терапию на область молочной железы и зоны регионарного метастазирования средними фракциями РОД 3Гр х 10-11 фракций до СОД 28-40Гр по изоэффекту. В зависимости от достигнутого эффекта выполнены оперативные вмешательства в объеме: радикальной резекции у 13 больных местнораспространенным РМЖ (43,3%), радикальной мастэктомии с сохранением грудных мышц – 17 пациенткам (56,7%). По данным гистологического исследования в операционном материале чаще всего обнаруживались признаки лечебного патоморфоза II степени – 10 пациенток (33,3%), у 9 больных – III степени (30%), у 5 - IV степени (16,7%). В 6 наблюдениях (20%) определены изменения, соответствующие 0-I степени патоморфоза. Оценены также основные клинико-морфологические факторы прогноза РМЖ: размер опухолевого узла, степень злокачественности, количество пораженных регионарных лимфатических узлов, статус рецепторов к эстрогенам и прогестерону в опухоли, экспрессия HER-2, наличие раковых эмболов в лимфатических и кровеносных сосудах по периферии опухоли.

    До начала неоадъювантного лечения всем больным проводилось определение уровня VEGFR-2 в сыворотках крови и в лизатах опухоли, полученной в результате трепанобиопсии. Динамика содержания рецептора оценена в опухоли в результате исследования операционного материала, в сыворотке крови больных - через 3-6 недель после хирургического лечения. Содержание VEGFR-2 в цитозолях и сыворотке крови определяли с помощью набора «Quantikine® Human VEGFR2 Immunoassay» (R&D systems, США) для прямого иммуноферментного анализа.

    Достоверность отличия средних значений оценивали по t - критерию Стьюдента. Корреляционные зависимости оценивали с помощью теста корреляции рангов Spearman. При сравнении и анализе взаимосвязи показателей использовали непараметрические тесты: U-критерий Mann-Whitney, медианный тест, критерий Wald-Wolfowits. Во всех случаях различия считали статистически достоверными при р < 0,05. Статистическая обработка данных проведена на персональном компьютере с помощью программного пакета «Statistica 6.0» (StatSoft Inc).

    Результаты исследования

    Мы обнаружили VEGFR-2 во всех полученных образцах опухоли и сыворотках крови до начала специфического лечения. Содержание VEGFR-2 в крови составляло от 7,9 до 17,8 нг/мг (медиана - 10,5 нг/мг). В образцах опухоли значения VEGFR-2 находились в пределах от 8,4 до 606,4 пг/мг белка (медиана - 165,2 пг/мг белка). Оценивая соотношение рецептора в двух исследуемых субстратах, мы не обнаружили достоверной корреляционной связи между содержанием VEGFR-2 в ткани и его сывороточной концентрацией (R=0,12, p=0,57).

    Анализ полученных данных до начала специфического лечения в зависимости от основных клинико-морфологических характеристик РМЖ мы представили в таблице 1. Значимых взаимосвязей содержания рецептора VEGFR-2 в сыворотке крови с возрастом, состоянием менструальной функции пациенток, распространенностью процесса и рецепторным статусом опухоли нами не обнаружено. Однако выявлено достоверное увеличение медианных значений растворимого VEGFR-2 у больных с гиперэкспрессией HER-2 (р=0,04).

    Оценка опухолевой экспрессии изучаемого рецептора выявила более интересные наблюдения. Содержание VEGFR-2 в опухоли было ниже у женщин в постменопаузе и у пациенток старше 55 лет по сравнению с молодыми больными, с сохранной менструально-овариальной функцией. Однако эти различия не были достоверны.

    Мы не также нашли значимой зависимости содержания VEGFR-2 в опухоли от ее размера, гистологического типа и степени злокачественности, но выделена тенденция положительной зависимости концентрации VEGFR-2 от стадии заболевания: медианные значения показателя превалировали в цитозолях РМЖ у больных с III b стадией по сравнению с группой больных со II a стадией. Возможно, это свидетельствует о необходимости в исследуемом факторе на стадии максимального местного роста РМЖ и постепенной утрате его значения в первичной опухоли на стадии метастазирования.

    Рецепторный статус опухоли не оказывал значимого влияния на тканевую экспрессию VEGFR-2. Проведенный анализ взаимосвязи содержания рецептора в ткани РМЖ с такими прогностически неблагоприятными факторами как гиперэкспрессия HER-2 и наличие раковых эмболов в лимфатических и кровеносных сосудах по периферии опухоли показал, что экспрессия VEGFR-2 имеет определенное клиническое значение: его цитозольная концентрация достоверно выше в опухолях с наличием раковых эмболов по периферии (р=0,01) и гиперэкспрессией белка HER-2 (р=0,03).

    На следующем этапе нашего исследования мы оценили влияние предоперационной терапии на содержание VEGFR-2 в сыворотке крови и в опухоли.

    В сыворотке крови уровень VEGFR-2 уменьшился у 12 больных на 0,1 - 4,8 нг/мл (медиана - 1,4 нг/мл), их них 50% наблюдений - в группе пациентов, получавших только лучевую терапию. Увеличение показателей VEGFR-2 чаще всего наблюдалось в группе больных, которым проведена химиолучевая терапия - 38% случаев, диапазон значений - от 1,0 до 42,5%, медиана составила 8,7% (Рис. 2).

    Рис. 2 Изменение содержания VEGFR-2 в сыворотках крови больных РМЖ в зависимости от вида предоперационного лечения.

    Определена положительная корреляция между исходными значениями VEGFR-2 в сыворотке крови и его показателями после проведения специфического лечения (R=0,45,p=0,024).

    Клиническая стадия заболевания, экспрессия HER-2, степень лечебного патоморфоза в остаточной опухоли не оказывали значимого влияния на динамику содержания растворимого VEGFR-2.

    В результате анализа изменений VEGFR-2 в сыворотке крови в зависимости от рецепторного статуса опухоли получены следующие данные: концентрация этого показателя после неоадъювантной терапии, как правило, увеличивалась у больных с положительным по рецепторам прогестерона РМЖ (медиана – 1,5 нг/мл), в то время как в группе рецепторотрицательных опухолей VEGFR-2 чаще снижался после лечения (медиана ~= 0,4 нг/мл) (р=0,018). Анализируя влияние эстрогенового статуса опухоли, медианные показатели изменений содержания сывороточного VEGFR-2 оказались практически одинаковыми в обеих группах.

    Наличие раковых эмболов в просветах лимфатических и кровеносных сосудов приводило к возрастанию уровня VEGFR-2 в сыворотке крови (медиана – 1,4 нг/мг), в то время как в 60% наблюдений отсутствия эмболов исследуемый фактор достоверно снижался после проведения специфической терапии (медиана ~= 0,5нг/мл) (р=0,02).

    Особый интерес в нашей работе был уделен оценке влияния предоперационной терапии на содержание рецептора VEGFR-2 в опухоли, а также сопоставлению полученных данных с эффектом лечения. VEGFR-2 снизился в 14% наблюдений (2-81%, медиана – 23%). У остальных пациентов содержание ангиогенного фактора, напротив, увеличилось, однако эти изменения не были достоверны. Показатели динамики экспрессии VEGFR-2 достоверно положительно коррелировали с его исходными значениями: т.е. чем выше была изначально концентрация VEGFR-2 в опухоли, тем в большей степени она снижалась после неоадъювантной терапии (R= -0,79, р<0,05). Динамика опухолевой экспрессии VEGFR-2 после проведения предоперационного лечения была направлена как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения во всех 3-х группах больных, причем степень этих изменений, в целом, была незначительна (Рис. 3).

    Рис. 3 Изменение содержания VEGFR-2 в цитозолях опухолей больных РМЖ в зависимости от вида предоперационного лечения.

    Возраст больных не влиял на изменение уровней VEGFR-2 в ткани опухоли в процессе неоадъювантной терапии, но определилась достоверная взаимосвязь динамики VEGFR-2 с менструальным статусом: концентрация VEGFR-2 в опухоли оставалась высокой у больных с сохранной менструальной функцией (медиана 201,9 пг/мг белка) по сравнению с группой пациенток, находящихся в перименопаузе (медиана 131,6 пг/мг белка, р=0,01).

    У больных с множественными метастазами в регионарные лимфоузлы (N3) уровень VEGFR-2 в опухоли оказался достоверно выше после проводимого лечения, чем у больных РМЖ без поражения регионарных лимфоузлов (N0) (р=0,03). В то же время в группе пациентов с опухолями, отрицательными и по рецепторам эстрогенов, и по рецепторам прогестерона, также достоверно чаще происходило снижение уровня VEGFR-2 на фоне терапии по сравнению с рецептороположительными опухолями (р<0,05).

    Определена четкая зависимость тканевой экспрессии VEGFR-2 от эффекта проведенной терапии, установленного при гистологическом исследовании операционного материала (табл. 2): чем более выражены изменения (IV степень лечебного патоморфоза), тем меньше был уровень VEGFR-2 в остаточной опухоли (p<0,05).

    В целом, наше исследование показало отсутствие достоверной корреляции между показателями VEGFR-2 в сыворотках крови и цитозолях опухоли. Опухолевая экспрессия VEGFR-2 была взаимосвязана с такими неблагоприятными факторами как гиперэкспрессия HER-2 и наличие раковых эмболов по периферии опухоли и, следовательно, обладала прогностической значимостью. Предоперационная терапия влияла на уровни VEGFR-2 в обоих исследуемых субстратах, однако направление и степень изменений не зависели от вида лечения. В то же время определена значимая взаимосвязь концентраций изучаемого ангиогенного фактора в опухолевой ткани с выраженностью лечебного патоморфоза.

    Литература

    1. Герштейн Е.С., Кушлинский Н.Е. Биологические маркеры рака молочной железы: методологические аспекты и клинические рекомендации. // Маммология 2005; (1): 65-70.
    2. Жукова Л.Г., Жуков Н.В., Личиницер М.Р. Экспрессия рецепторов VEGF FLT-1 и FLK-1 на опухолевых клетках - новый фактор прогноза при местно-распространенном раке молочной железы // Бюлл. эксп. биол. мед.-2003.-T. 135 (5).-C. 478-481.
    3. Кушлинский Н.Е., Герштейн Е.С. Роль фактора роста эндотелия сосудов при раке молочной железы // Бюлл. эксп. биол. мед. – 2002. – Т. 133, №6. – С. 604–612.
    4. Щербаков А.М., Герштейн Е.С., Анурова О.А., Кушлинский Н.Е. Фактор роста эндотелия сосудов и его рецепторы первого и второго типа при раке молочной железы. // Вопросы онкологии. – 2005. - Т.51 - №3. - С.317-321.
    5. Devries C., Escobedo J.A., Ueno H. et al. The fms-like tyrosine kinase, a receptor for vascular endothelial growth factor // Science. - 1992. - Vol. 255. - P. 989-991.
    6. Ferrara N. The role of VEGF in the regulation of physiological and pathological angiogenesis//Exs.-2005.-Vol. (94).-P. 209-231
    7. Foekens J.A., Peters H.A. et al. High tumor levels of vascular endothelial growth factor predict poor response to systemic therapy in advanced breast cancer // Cancer Res. - 2002. - Vol. 61. - N 14. - P. 5407-5414.
    8. Folkman J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease // Nat Med. – 1995. – V. 1 – P. 27-31.
    9. Gasparini G. Prognostic value of vascular endothelial growth factor in breast cancer // Oncologist. 2000. Vol. 5, Suppl.1 P. 37-44.
    10. Linderholm B.K., Lindh B., Beckman L. et al. Prognostic correlation of basic fibroblast growth factor and vascular endothelial growth factor in 1307 primary breast cancers. // Clin Breast Cancer. - 2003. - Vol. 4. - N5. - P. 340-347.
    11. Relf M., LeJeune S., Scott PA. et al. Expression of the angiogenic factors vascular endothelial cell growth factor, acidic and basic fibroblast growth factor, tumor growth factor beta-1, platelet-derived endothelial cell growth factor, placenta growth factor, and pleiotrophin in human primary breast cancer and its relation to angiogenesis // Cancer Res. - 1997. - Vol. 57. - N5. - P.963-969.
    12. Ryden L., Jirstrom K., Bendahl P.O. et al. Tumor-specific expression of vascular endothelial growth factor receptor 2 but not vascular endothelial growth factor or human epidermal growth factor receptor 2 is associated with impaired response to adjuvant tamoxifen in premenopausal breast cancer // J. Clin Oncol. - 2005. - Vol. 23 (21). - P.4695-4704.
    13. Shibuya M., Ito N., Claesson-Welsh L. Structure and function of vascular endothelial growth factor receptor-1 and -2. // Curr. Top. Microbiol. Immunol. - 1999. - Vol. 237. - P.59-83.
    14. Speirs V., Atkin S. L. Production of VEGF and expression of the VEGF receptors Flt-1 and KDR in primary cultures of epithelial and stromal cells derived from breast tumours // Br. J. Cancer. - 1999. - Vol.80. - N5-6. - P. 898-903.
    15. Terman B.I., Vermazen M.D., Carrion M.E. et al. Identification of the KDR tyrosine kinase as a receptor for vascular endothelial cell growth factor // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1992. - Vol.34. - P.1578-1586.
    16. Toi M., Inada K., Suzuki H. et al. Tumor angiogenesis in breast cancer: its importance as a prognostic indicator and the association with vascular endothelial growth factor expression // Breast Cancer Res Treat. – 1995 - Vol.36 - N.2 - P.193-204

    Таблица 1

    Содержание VEGFR-2 в цитозолях опухолей и сыворотке крови больных РМЖ в зависимости от клинико-морфологических характеристик заболевания

    Характеристика VEGFR-2
    n В сыворотке крови В опухоли
    нг/мл пг/мг белка

    Возраст:

    Моложе 40 лет

    40 - 55 лет

    Старше 55 лет

    P

    5

    17

    8

    11,2 (8,7 – 12,4)

    10,5 (9,9 – 12,1)

    10,2 (9,0 – 11,7)

    NS

    161 (141 – 208,2)

    202,9 (142 – 277,8)

    156,4 (103,4 –165)

    NS

    Менопаузный статус:

    Сохр. менстр. функция

    Перименопауза

    Менопауза

    P

    10

    7

    13

    11,8 (9,1 – 13,8)

    11,0 (10 – 11,8)

    10,0 (9,7 – 10,4)

    NS

    208,9 (146,7 – 247)

    165,1 (104,8-202,9)

    153,1 (89,2-240,3)

    NS

    Стадия:

    II а

    II б

    III а

    III б

    III c

    P

    3

    9

    3

    12

    3

    11,0 (10,6 – 11,3)

    10,5 (9,1 – 12,8)

    10,3 (9,8 – 10,4)

    11,5 (9,0 – 12,2)

    10,7 (10,4 – 11,4)

    NS

    163 (156,4 – 183,6)

    161 (141 – 202,9)

    209,7 (203 -294,4)

    184 (103,4 – 233,5)

    153 (89,3 – 379,8)

    NS

    Размер опухоли:

    Т2

    Т4

    P

    15

    15

    10,3 (9,3 – 11,7)

    11,4 (9,8 – 12,2)

    NS

    165,2 (145,9 –207)

    165,1 (102 – 240,1)

    NS

    Метастазы в лимфатич. узлы:

    N0

    N1

    N2

    N3

    P

    4

    11

    12

    3

    11,6 (10,9 – 11,7)

    9,4 (8,8 – 12,1)

    10,9 (9,9 – 12,2)

    10,7 (10,4– 11,4)

    NS

    156,4 (120 – 173,3)

    161 (92,3 – 205,6)

    206,3 (157,5-278,3)

    153,1 (89,3– 379,8)

    NS

    Статус HER-2:

    0 - 2+

    2/3 – 3+

    Р

    19

    7

    5

    10,3 (9,0 – 11,5)

    12,2 (11,1–12,9)

    =0,041

    165,2(145,9–208,9)

    204,3(36,4–327,7)

    =0,032

    Раковые эмболы:

    есть

    нет

    Р

    12

    18

    10,9 (9,9 - 12)

    10,5 (9,0 – 11,7)

    183,6 (132 - 258,3)

    165,2 (136,6 - 208)

    =0,013

    Статус РЭ:

    +

    P

    13

    17

    11,7 (9,9-12,8)

    10,3 (9,4 – 11,1)

    NS

    163 (43,7-204,3)

    197 (141 – 277,8)

    NS

    Статус РП:

    +

    P

    9

    21

    10,7 (9,3 - 11,5)

    10,4 (9,5 – 12,3)

    NS

    202,9 (150 – 208,2)

    163 (104,8 – 226,8)

    NS

    1тест Манна-Уитни

    2тест Вальда-Вольвофица

    3тест Вальда-Вольвофица

    NS – различия недостоверны

    Таблица 2.

    Содержания VEGFR-2 в опухоли больных РМЖ после лечения в зависимости от степени лечебного патоморфоза.

    Лечебный патоморфоз

    Число больных

    VEGFR-2, пг/мг

    М ± m

    Медиана Квартили

    0-Iст.

    6

    240,6 ± 130,1

    203,91

    161,4 - 268,3

    IIст.

    10

    155,1 ± 44,6

    154,9

    131,5 - 183,0

    IIIст.

    9

    245,4 ± 73,6

    249,4

    200,3 - 295,3

    IVст.

    5

    165,2 ± 37,7

    170,0

    131,6 - 191,7

    1р=0,04 (критерий Крускала-Уоллиса).